電子移動反応を利用したDNA塩基配列における点突然変異の検出法の開発

开发利用电子转移反应检测 DNA 碱基序列点突变的方法

基本信息

批准号：
08750941
负责人：
井原敏博
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

塩基の置換、追加、欠失などがある部位では塩基のスタッキングが乱れている。塩基のスタッキング-π電子のカラム-がDNA上での移動に寄与しているならば、この変位部位(導線の断線に例えることができる)をはさむドナー-アクセプター間の電子移動反応は抑制されるであろう。本研究では、DNA上での光誘起電子移動反応を利用し、均一溶液中における遺伝子中の点変異の検出法の開発を目的として以下の研究を行った。ここで電子ドナー(D)とアクセプター(A)は共にDNA結合性をもったものを使用した。最初にDとAの選択を行った。相補的な二本鎖DNA共存下、D-Aの種々の組み合わせで電子移動効率を比較した結果、インターカレータ性のもの同士の組み合わせの場合に最もDNAによる電子移動の促進効果が顕著であった。このことはDNA上での電子移動には、DNA塩基のπ電子との接触が重要であることを示している。次に、D-Aをそれら(インターカレータ同士)に固定して変異検出の実験を行った。具体的には、まず、種々の変異を含むオリゴヌクレオチドを化学合成した。これらの二本鎖オリゴヌクレオチド共存下、D溶液にA溶液を滴定してゆき、それに伴うDの蛍光の電子移動消光を観察し、得られた結果を共存させたオリゴヌクレオチドに関して比較した。その結果、ミスマッチ、AP部位(β-グリコシド結合が切れて脱塩基を起こした部位)を含むDNAの共存系では、相補的なDNAを用いた場合に比べ電子移動効率が有意に低下した。即ち、これらの変異が連続的なπ電子のスタッキングを乱し、電子の移動を抑制したものと考えられる。本法は、均一系でRIに依らない簡便な新規遺伝子検出法の可能性を示唆するものであり、遺伝子診断の分野に寄与するところは大きい。

基础堆叠在基础替换，添加，缺失等的位置被破坏。在这项研究中，进行了以下研究，目的是开发一种使用光诱导的电子转移反应在DNA上检测均质溶液中基因突变的方法。在这里，将电子供体（D）和受体（a）都与DNA结合特性一起使用。首先，我选择了D和A。在存在互补的双链DNA的情况下，将电子转移效率与D-A的各种组合进行比较，并且当使用类似嵌入量的组合时，最明显的DNA促进电子传递的效果。这表明与DNA碱基的π电子接触对于通过DNA的电子转移很重要。接下来，将D-A固定在这些（Intercalator）上，并进行突变检测实验。具体而言，首先将含有各种突变的寡核苷酸化学合成。在存在这些双链寡核苷酸的情况下，将A溶液滴定到D溶液中，并观察到伴随的电子转移D的D溶液，并观察到D的荧光，并将所获得的结果与观察到共存在的寡核苷酸进行了比较。结果，与使用互补DNA时，电子传递效率相比，电子转移效率显着降低，其中含有错配和AP位点的DNA共存（β-糖苷键断裂和浸信）。也就是说，这些突变扰乱了π电子的堆叠和抑制电子运动。该方法提出了不取决于RI的均质，简单，新颖的基因检测方法的可能性，并有助于遗传诊断领域。