微小電極と合成モレキュラー・プローブによる生物膜・グラニュール汚泥の菌叢動態解析

使用微电极和合成分子探针分析生物膜和颗粒污泥中的细菌菌群动态

• 批准号: 09680545
• 负责人: 原田 秀樹
• 金额: $ 2.37万
• 依托单位: Nagaoka University of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-09680545/
• 关键词: FISH法; in-situ hybridization; 16S rRNA; 古細菌; 嫌気性汚泥; グラニュール汚泥; メタン生成菌; 微小電極

本研究では、集塊化増殖体内でのin situな物質代謝特性把握するために,先端径が10〜20μm程度のガラス製チップで構成される種々の微小電極(Microelectrodes)センサーを開発製作し,嫌気性微生物アグリゲート(UASB反応器で培養されたグラニュール汚泥)および好気性微生物アグリゲート(固定担体上に形成された生物膜)に適用して,アグリゲート体内の任意の現位置での目的物質濃度を検出した。種々のバルク液条件下で平衡化させたフロー・セル反応器に嫌気性グラニュールもしくは好気性生物膜を固定し,マイクロセンサーを深部方向に30〜100μmピッチで貫入させて、種々の濃度勾配を測定した。作成したセンサー種は (1)嫌気性グラニュール汚泥に対して:pHセンサー/グルコース・センサー/硫化イオンセンサー (2)好気性生物膜に対して;pHセンサー/グルコース・センサー/DOセンサー/アンモニア性窒素イオンセンサー/硝酸性窒素イオンセンサー、である。さらにアグレゲート内の微生物生態学的構造を直接的に定量評価するために、種レベル、属レベルで16S rRNAをターゲットとした合成DNAプローブを設計し、In situ hybridizationして蛍光顕微鏡で目的菌を判別し、画像解析から存在量を定量化した。FISH対象菌グループとしては、(1)嫌気性グラニュールに対しては、古細菌、水素資化性メタン生成細菌、酢酸資化性メタン生成細菌、水素生産性酢酸生成菌、硫酸還元菌等について、(2)好気性生物膜試料についてはEubacteria、硝化細菌(アンモニア酸化細菌、亜硝酸酸化細菌)を定量把握した。また、ウルトラ・ミクロトームを用いて嫌気性グラニュール及び好気性生物膜を深部方向に層別切片試料を得て、FISHを適用し、アグリゲート内の深度方向菌叢分布を計測した。

In this study, the metabolic characteristics of the substances in the aggregated colonies were grasped, and the tip diameter was about 10 ~ 20μm.(Microelectrodes) The development of microelectrodes allows detection of concentrations of target substances at any location in the body, especially in the presence of toxic microorganisms (UASB reactors, culture media, sludge) and toxic microorganisms (biofilms formed on stationary supports). Under the condition of seed solution, the concentration of seed in the reactor was determined by the concentration of seed in the deep direction of 30 ~ 100μm. To prepare the following solutions: (1) pH value of toxic sludge solution:pH value of toxic sludge solution: pH value of The structure of the microbial ecology In the field is directly and quantitatively evaluated, and the 16S rRNA is designed and synthesized. In situ hybridization, the target bacteria are identified by light microscopy, and the presence amount is quantitatively analyzed. FISH was used to quantify the presence of Eubacteria and nitrifying bacteria in biofilms, such as (1) archaea, aqueous-producing bacteria, acid-producing bacteria, aqueous-producing acid-producing bacteria, sulfate reducing bacteria, etc. For the measurement of bacterial flora distribution in depth, FISH was used to determine the depth of stratified samples from deep biofilms.

项目成果

大橋晶良,原田秀樹,小山孝: "生物膜の剥離抵抗因子・付着と引張強度の新規試験機による評価" 環境工学研究論文集. vol.35. 329-338 (1998)

Akiyoshi Ohashi、Hideki Harada、Takashi Koyama：“使用新型试验机评估生物膜的剥离阻力系数、粘附力和拉伸强度”环境工程研究杂志第 35 卷（1998 年）。

関口勇地,大橋晶良,原田秀樹: "嫌気性グラニュール汚泥からのrDNA遺伝子のクローニングから推定された未知の細菌群の検出とその空間分布-rRNAからみた中温・高温グラニュールの微生物群集構造比較" 環境工学研究論文集. vol.35. 427-428 (1998)

Yuji Sekiguchi、Akira Ohashi、Hideki Harada：“从厌氧颗粒污泥中克隆 rDNA 基因估计未知细菌群的检测及其空间分布 - 从 rRNA 观察中温和高温颗粒微生物群落结构的比较”《环境工程》研究论文。第 35 卷。427-428（1998）

荒木信夫、大橋晶良、原田秀樹: "FISH法を適用した生物膜硝化細菌の菌数計測と空間分布の観察" 水環境学会誌. vol.22. 635-639 (1999)

Nobuo Araki、Akiyoshi Ohashi、Hideki Harada：“使用 FISH 方法计算生物膜硝化细菌的数量并观察其空间分布”日本水环境学会杂志第 22 卷（1999 年）。

大橋晶良、原田秀樹、珠坪一晃、関口勇地、角野晴彦: "開発途上国のための低コスト型新規下水処理システムの性能評価" 環境工学研究論文集. vol.34. 173-182 (1997)

Akiyoshi Ohashi、Hideki Harada、Kazuaki Tamatsubo、Yuji Sekiguchi、Haruhiko Kadono：“发展中国家新型低成本污水处理系统的性能评估”环境工程研究杂志 34. 173-182 (1997)。

珠坪一晃、関口勇地、原田秀樹、大橋晶良、多川正、大関弘和、荒木信夫: "16SrRNA標的モレキュラー・プローブのIn-situ Hybridizationによる嫌気性汚泥微生物叢の生態学的構造解析" 環境工学研究論文集. vol.34. 51-60 (1997)

Kazuaki Tamatsubo、Yuji Sekiguchi、Hideki Harada、Akira Ohashi、Tadashi Takawa、Hirokazu Ozeki、Nobuo Araki：“通过 16SrRNA 靶向分子探针原位杂交进行厌氧污泥微生物区系的生态结构分析”环境工程研究论文集。 34. 51-60 (1997)