微小電極と合成モレキュラー・プローブによる生物膜・グラニュール汚泥の菌叢動態解析

本研究では、集塊化増殖体内でのin situな物質代謝特性把握するために,先端径が10〜20μm程度のガラス製チップで構成される種々の微小電極(Microelectrodes)センサーを開発製作し,嫌気性微生物アグリゲート(UASB反応器で培養されたグラニュール汚泥)および好気性微生物アグリゲート(固定担体上に形成された生物膜)に適用して,アグリゲート体内の任意の現位置での目的物質濃度を検出した。種々のバルク液条件下で平衡化させたフロー・セル反応器に嫌気性グラニュールもしくは好気性生物膜を固定し,マイクロセンサーを深部方向に30〜100μmピッチで貫入させて、種々の濃度勾配を測定した。作成したセンサー種は (1)嫌気性グラニュール汚泥に対して:pHセンサー/グルコース・センサー/硫化イオンセンサー (2)好気性生物膜に対して;pHセンサー/グルコース・センサー/DOセンサー/アンモニア性窒素イオンセンサー/硝酸性窒素イオンセンサー、である。さらにアグレゲート内の微生物生態学的構造を直接的に定量評価するために、種レベル、属レベルで16S rRNAをターゲットとした合成DNAプローブを設計し、In situ hybridizationして蛍光顕微鏡で目的菌を判別し、画像解析から存在量を定量化した。FISH対象菌グループとしては、(1)嫌気性グラニュールに対しては、古細菌、水素資化性メタン生成細菌、酢酸資化性メタン生成細菌、水素生産性酢酸生成菌、硫酸還元菌等について、(2)好気性生物膜試料についてはEubacteria、硝化細菌(アンモニア酸化細菌、亜硝酸酸化細菌)を定量把握した。また、ウルトラ・ミクロトームを用いて嫌気性グラニュール及び好気性生物膜を深部方向に層別切片試料を得て、FISHを適用し、アグリゲート内の深度方向菌叢分布を計測した。

本研究では、集塊化増殖体内でのin situな物質代謝特性把握するために,先端径が10〜20μm程度のガラス製チップで構成される種々の微小電極(Microelectrodes)センサーを開発製作し,嫌気性微生物アグリゲート(UASB反応器で培養されたグラニュール汚泥)および好気性微生物アグリゲート(固定担体上に形成された生物膜)に適用して,アグリゲート体内の任意の現位置での目的物質濃度を検出した。種々のバルク液条件下で平衡化させたフロー・セル反応器に嫌気性グラニュールもしくは好気性生物膜を固定し,マイクロセンサーを深部方向に30〜100μmピッチで貫入させて、種々の濃度勾配を測定した。作成したセンサー種は (1)嫌気性グラニュール汚泥に対して:pHセンサー/グルコース・センサー/硫化イオンセンサー (2)好気性生物膜に対して;pHセンサー/グルコース・センサー/DOセンサー/アンモニア性窒素イオンセンサー/硝酸性窒素イオンセンサー、である。さらにアグレゲート内の微生物生態学的構造を直接的に定量評価するために、種レベル、属レベルで16S rRNAをターゲットとした合成DNAプローブを設計し、In situ hybridizationして蛍光顕微鏡で目的菌を判別し、画像解析から存在量を定量化した。FISH対象菌グループとしては、(1)嫌気性グラニュールに対しては、古細菌、水素資化性メタン生成細菌、酢酸資化性メタン生成細菌、水素生産性酢酸生成菌、硫酸還元菌等について、(2)好気性生物膜試料についてはEubacteria、硝化細菌(アンモニア酸化細菌、亜硝酸酸化細菌)を定量把握した。また、ウルトラ・ミクロトームを用いて嫌気性グラニュール及び好気性生物膜を深部方向に層別切片試料を得て、FISHを適用し、アグリゲート内の深度方向菌叢分布を計測した。