試験管内転写tRNAを用いた再構成型酵母翻訳系による非天然アミノ酸導入システム

使用体外转录的 tRNA 的重组酵母翻译系统的非天然氨基酸引入系统

• 批准号: 22K19264
• 负责人: 富田 野乃
• 金额: $ 4.16万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-06-30 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19264/
• 关键词: 無細胞翻訳系; 非天然アミノ酸; 酵母; 試験管内転写tRNA

本研究では、近年申請者が構築した試験管内転写tRNA(iVT tRNA)を用いた再構成型酵母翻訳系を利用し、高分子タンパク質内部に複数種類の非天然アミノ酸を同時に導入できるシステムを確立する。当該酵母翻訳系は、21種類のiVT tRNAによって構成されており、終止コドンの他、計34種類のセンスコドンがアミノ酸を指定しない空コドンとなる。これら空コドンに非天然アミノ酸を割り当てることにより、異なる種類の非天然アミノ酸をタンパク質の複数箇所に導入できる筈である。当該年度は、モデルタンパク質(nLuc)へ非天然アミノ酸を導入し、導入効率のコドン依存性、非天然アミノ酸の種類依存性、を評価した。1. 導入効率のコドン依存性の解析はじめに、UAG終止コドンと3種の空コドン(AGC、AGG、UUG)への非天然アミノ酸(D-Phe)の導入効率を解析した。D-PheはフレキシザイムによりiVT tRNACysにチャージさせた。UAG終止コドンではeRF1非存在下においてのみD-Pheを導入できた。AGG空コドンではeRF1存在下でもD-Pheを導入できた。AGCとUUG空コドンでは何らかの天然アミノ酸も誤導入されることが示された。未修飾iVT tRNAは、AGCやUUGなど特定の空コドンにおいて誤読をおこすことが明らかとなった。2. 非天然アミノ酸の種類依存性SPIEDACクリックケミストリーに対応する非天然アミノ酸TCO*Lysの導入効率を評価した。TCO*Lysはメタン生成古細菌由来PylRSを利用して　iVT tRNAPylにチャージさせた。TCO*LysはUAG終止コドンおよび、AGGや AGC、UUG空コドンにおいてeRF1存在下で導入された。従来eRF1より強く終止コドンに結合できるtRNAは知られていなかったが、tRNAPyl が極めて強いコドン結合能を有することを見出した。

In this study and in recent years, applicants have reported that tRNA (iVT tRNA) is used in the tube to reconstruct the yeast system, and that the complex numbers in the high molecular weight system are not natural. At the same time, it is necessary to make sure that it is not natural. When the yeast system, 21 iVT tRNA system, do not change the system, do not change the system, please do not specify the system. In the case of non-natural materials, such as non-natural materials, non-natural materials, such as non-natural materials, non-natural materials, such as non-natural materials, the number of complex data. In the current year, the non-natural acid consumption (nLuc) is very high, the input rate is highly dependent, the non-natural acid dependence, the non-natural acid dependence, and so on. 1. The input rate is different from that of dependence analysis, and the UAG analysis is based on the analysis of the input rate of unnatural acid (D-Phe), which is not natural (AGC, AGG, UUG). D-Phe has a lot of money to do. It doesn't have to be the same as iVT tRNACys. The UAG does not exist. The eRF1 does not exist. It does not exist. The D-Phe is imported. In the presence of the AGG blank eRF1, the D-Phe has entered the database. AGC

项目成果

Reconstitution of mammalian mitochondrial translation system capable of long polypeptide synthesis

能够合成长多肽的哺乳动物线粒体翻译系统的重建

• 发表时间: 2023
• 期刊: Methods in Molecular Biology
• 作者: Muhoon Lee;Nono Takeuchi-Tomita
• 通讯作者: Nono Takeuchi-Tomita