NMRを用いた紫外線損傷DNA修復機構の構造生物学的解析

生体に紫外線を照射すると、細胞内のDNAが損傷を受ける。損傷塩基は複製・転写時に変異を誘発し、細胞死やがん化の原因になる。生体には光を用いて紫外線損傷DNAを修復する酵素が存在する。その修復機構を解明し、修復効率を飛躍的に高めることが出来れば、損傷DNA治療によるがん化の予防という実用的な応用も可能となる。本研究は、代表的な紫外線損傷DNAであるシクロブタンピリミジンダイマー(CPD)の光修復酵素であるCPD-photolyaseによる認識・修復機構を原子レベルで解明し、さらに、高い修復効率を有する分子を創製すること、および、もう1つの代表的な光損傷DNAである(6-4)photoproductとその修復酵素である(6-4)photolyaseについても、認識・修復機構を明らかにすることを目的とする。2つの修復酵素を併用することにより、がん化の予防効果も相乗的に高まると考えられる。本年度は、CPD含有二本鎖DNA複合体構造決定を行うための、CPD含有長鎖二本鎖DNAの調製に成功した。また、高熱菌由来CPD photolyaseの精製法に改善を加えた結果、新たに第二補酵素を同定し、第二補酵素を着脱出来る条件を確立した。さらに、修復活性に対する第二補酵素の機能解析を進め、光アンテナとして効率の良い集光に寄与することを明らかにした。アフリカツメガエル由来(6-4)photolyaseについて、大腸菌を用いた発現系を数種類構築し、発現量の良好なものを得た。測定を行った結果、(6-4)photolyaseが立体構造を保持していることを示す、NMRシグナルの良好な分散が観測された。同時に、(6-4)photolyaseのC末端に存在する核移行シグナル領域がランダムな構造であることを明らかにした。これを除いた結果、NMRシグナルの強度を均一にすることが出来た。

生体に紫外線を照射すると、細胞内のDNAが損傷を受ける。損傷塩基は複製・転写時に変異を誘発し、細胞死やがん化の原因になる。生体には光を用いて紫外線損傷DNAを修復する酵素が存在する。その修復機構を解明し、修復効率を飛躍的に高めることが出来れば、損傷DNA治療によるがん化の予防という実用的な応用も可能となる。本研究は、代表的な紫外線損傷DNAであるシクロブタンピリミジンダイマー(CPD)の光修復酵素であるCPD-photolyaseによる認識・修復機構を原子レベルで解明し、さらに、高い修復効率を有する分子を創製すること、および、もう1つの代表的な光損傷DNAである(6-4)photoproductとその修復酵素である(6-4)photolyaseについても、認識・修復機構を明らかにすることを目的とする。2つの修復酵素を併用することにより、がん化の予防効果も相乗的に高まると考えられる。本年度は、CPD含有二本鎖DNA複合体構造決定を行うための、CPD含有長鎖二本鎖DNAの調製に成功した。また、高熱菌由来CPD photolyaseの精製法に改善を加えた結果、新たに第二補酵素を同定し、第二補酵素を着脱出来る条件を確立した。さらに、修復活性に対する第二補酵素の機能解析を進め、光アンテナとして効率の良い集光に寄与することを明らかにした。アフリカツメガエル由来(6-4)photolyaseについて、大腸菌を用いた発現系を数種類構築し、発現量の良好なものを得た。測定を行った結果、(6-4)photolyaseが立体構造を保持していることを示す、NMRシグナルの良好な分散が観測された。同時に、(6-4)photolyaseのC末端に存在する核移行シグナル領域がランダムな構造であることを明らかにした。これを除いた結果、NMRシグナルの強度を均一にすることが出来た。