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ＰＰＲ蛋白質を利用した標的ＲＮＡ特異的改変システムの開発

利用PPR蛋白开发靶RNA特异性修饰系统

基本信息

批准号：
13J04569
负责人：
八木祐介
金额：
$ 2.76万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13J04569/
关键词：
RNA PPR RNA分解ヌクレアーゼタンパク質工学葉緑体ミトコンドリア

项目摘要

本研究は、植物のみで非常に拡大したRNA結合蛋白質ファミリーであるPPR蛋白質に着目し。その特性を利用することで様々なRNA配列に結合する人工RNA結合蛋白質を構築し、RNaseをそれと融合することで標的特異的な細胞内RNA分解系を作成しようというものである。昨年度までに、1. 動物培養細胞を用いたPPR蛋白質とRNAの結合の検出システム、2.任意RNA配列に結合するPPR蛋白質の作成方法について確立できた。現状では成功確率は低いが、完成したカスタムPPR蛋白質を用いて、RNA分解酵素や翻訳抑制因子のようなエフェクタードメインを連結し、細胞内mRNAの翻訳抑制手法の構築を目標に今年度は研究を行った。まず、既知の様々なRNase domainや翻訳抑制因子などをcloningし、それらと昨年度作成したPPR蛋白質を融合し、reporter assayを用いてRNA分解、翻訳抑制効果を検証した。その結果、最大で50%程の標的蛋白質の抑制効果が見られた。さらに、翻訳抑制可能なドメインのスクリーニングが完了したので、実際に内在遺伝子を標的でき、発現抑制が可能なカスタムPPR蛋白質を作成した。その結果、内在mRNAに対しても検証を行い、20-30%程度ではあるが、抑制効果が見られた。今後、PPRと抑制ドメイン間のリンカー配列の検討や、PPR蛋白質の発現安定性などを改良し最適化することで、さらに機能的な人工RNaseが作成できると考えている。

In this study, plant RNA binding proteins were found to be very important for PPR protein. The characteristics of RNA binding protein construction, RNase fusion, and target specific intracellular RNA degradation system were used to construct RNA binding protein. Last year, 1. 2. Establishment of PPR protein binding method for arbitrary RNA alignment in animal culture cells The current situation is that the success rate is low, the completion rate of PPR protein is high, the RNA decomposition enzyme and the inversion inhibitor are linked, and the construction of intracellular mRNA inversion inhibition method is studied this year. We know that the RNase domain and the transcription inhibitor gene are cloned, and the PPR protein is fused and the reporter assay is used to detect the RNA decomposition and transcription inhibitor gene. The results showed that the inhibition effect of the target protein with a maximum of 50% was observed. In addition, it is possible to produce PPR protein in the presence of an intrinsic protein target. 20-30% of the results, the intrinsic mRNA, the inhibitory effect, In the future, PPR protein expression stability will be improved, and functional artificial RNase will be prepared.