昆虫における効率的な遺伝子ノックインシステムの構築

昆虫高效基因敲入系统的构建

基本信息

批准号：
13F03387
负责人：
日下部宜宏
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

カイコは、モデル昆虫、産業昆虫として、多様な遺伝子組換え昆虫が作出されいる。一方、遺伝子ノックインは、究極の遺伝子操作技術であると考えられているが、その効率は極めて低い。しかし、ゲノム編集技術の技術革新により、遺伝子破壊は可能となった。さらに、遺伝子ノックインを効率的に誘導するためには、DNA切断後、相同組換え（HR）を誘導する必要がある。このような状況を踏まえて、本研究では、カイコNHEJ関連因子の機能を明らかにするとともに、両経路間のクロストークを明らかにし、それらを制御することで、効率良く遺伝子ノックインを誘導する方法の確立を目指した。まず、カイコNHEJ関連因子、およびHR関連因子の同定と機能解析を行った。同時に、新規NHEJ活性測定用のアッセイシステムを構築し、既存のHRアッセイ系と組み合わせることにより、樹立したアッセイ細胞において機能阻害し、NHEJ経路への影響、及びNHEJ経路を抑制した際にHR修復経路に与える影響を解析した。カイコNHEJ関連遺伝子と想定していた遺伝子の多くは、機能阻害によりNHEJ効率が著しく低下したことから、これらの機能不全が、効率的な遺伝子ターゲティングを誘導できることを示唆していた。そこで、NHEJ関連遺伝子についてノックアウト細胞を樹立した。次いで、ゲノム編集用のCRISPERと同時にHRの鋳型となるDNAを導入したところ、TUDOR-SN遺伝子内の相同配列とカイコゲノム間で、遺伝子ターゲティングが誘導され、TUDOR-SN遺伝子内に正確にGFP遺伝子をノックインすることができた。また、その際、挿入のための相同性のあるアーム部分の長さは、100 bpから250 bpで十分であることも確認できた。この場合、RNAiによるNHEJ関連遺伝子機能阻害細胞でより効率的に遺伝子ノックインが誘導できることを明らかにした。

作为模型昆虫和工业昆虫，蚕虫产生了多种转基因的昆虫。另一方面，基因敲入被认为是最终的基因工程技术，但其效率极低。但是，基因组编辑技术的技术创新使破坏基因成为可能。此外，为了有效诱导基因敲入，必须在DNA裂解后诱导同源重组（HR）。考虑到这一点，这项研究旨在通过揭示蚕NHEJ相关因素的功能以及阐明这两种途径之间的串扰并控制它们的串扰来建立一种有效诱导基因敲入的方法。首先，我们确定了蚕NHEJ相关因素和HR相关因素的功能分析。同时，构建了用于测量NHEJ活性的新型测定系统，并与现有的HR分析系统结合了既定的测定单元中的功能抑制作用，以及对NHEJ途径的影响，以及抑制NHEJ途径时对HR修复途径的影响。假定为蚕的许多基因与NHEJ相关的基因都表明，这些功能障碍可能诱导有效的基因靶向，因为功能的抑制显着降低了NHEJ效率。因此，为NHEJ相关基因建立了基因敲除细胞。接下来，在引入了Crister基因组编辑的同时，引入了作为HR模板的DNA，并且在Tudor-SN基因内的同源序列和蚕虫基因组中诱导了基因靶向，从而可以准确地将GFP基因敲入Tudor-SN基因中。还可以证实，100 bp至250 bp足以足以与同源性插入的手臂部分的长度。在这种情况下，我们透露，在抑制RNAi抑制NHEJ相关基因功能的细胞中，可以更有效地诱导基因敲输入。