浙江大学研究：结直肠癌中关键糖酵解酶ENO1的糖基化修饰在糖代谢与免疫逃逸中的双重作用

原创1620阅读 2025-03-31 15:34:26

近日，“PNAS”（IF=9.4）上发表了一篇题为“O-GlcNAcylation of enolase 1 serves as a dual regulator of aerobic glycolysis and immune evasion in colorectal cancer”的文章。这篇文章研究了O-GlcNAcylation（O-乙酰葡萄糖胺化）对结直肠癌中的关键糖酵解酶ENO1的双重调控作用。

研究背景介绍

O-乙酰葡萄糖胺糖基化修饰（O-GlcNAcylation）是一种蛋白质翻译后修饰，涉及将N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）添加到蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基上。这种修饰在细胞内扮演着重要角色，包括调节蛋白质的稳定性、亚细胞定位和活性。

α-烯醇化酶1（ENO1）是一种在糖酵解途径中起关键作用的酶，它催化2-磷酸甘油酸（2-PG）转化为磷酸烯醇丙酮（PEP）。除了其在糖酵解中的作用，ENO1还参与多种非代谢功能，包括基因转录、蛋白质翻译以及肿瘤免疫逃逸。

研究思路分析

01ENO1的酶活性与肿瘤生长

①CRC细胞依赖有氧糖酵解增殖，研究发现ENO1在CRC组织及细胞系中高表达，其敲低抑制细胞增殖和糖酵解，该效应可被野生型ENO1逆转，表明ENO1酶活性对CRC细胞增殖和肿瘤生长关键。

②研究显示，O-GlcNAcylation影响多种代谢酶活性，调节细胞代谢。实验发现，OGA抑制剂Thiamet G（TMG）存在或OGT过表达时，ENO1的O-GlcNAcylation信号显著增加。通过质谱分析鉴定了四个可能的O-GlcNAcylation位点（T19、T26、S27和S249），发现T19A和S249A突变显著降低了O-GlcNAcylation信号，而双位点突变（T19A/S249A）几乎完全消除了糖基化信号，表明T19和S249是ENO1上的主要糖基化位点。

③进一步实验表明，T19位点的O-GlcNAcylation能够增强ENO1的酶活性，而这种活性增强与ENO1的磷酸化状态无关。此外，T19位点的O-GlcNAcylation通过促进ENO1形成活性二聚体来增强其酶活性，而T19A突变则破坏了ENO1的这种二聚体形成。表明O-GlcNAcylation在调节ENO1活性中的重要作用。

02O-GlcNAcylation对糖酵解和肿瘤生长的影响

①研究发现ENO1的O-GlcNAcylation对CRC细胞的糖酵解和肿瘤生长有显著影响。OGT过表达在WT ENO1重组细胞中增加了葡萄糖摄取、乳酸和ATP产生，并提高了细胞外酸化率（ECAR），而T19A突变型ENO1重组细胞中这些效应较弱。

②此外，ENO1的O-GlcNAcylation在CRC细胞中上调，且与细胞增殖和肿瘤形成能力增强相关。在动物模型中，WT ENO1的重新表达能够逆转因ENO1耗竭导致的肿瘤生长抑制，而T19A ENO1重组细胞效果较弱。OGT过表达进一步促进了WT ENO1重组细胞的肿瘤生长和Ki67表达增加，但对T19A ENO1重组细胞没有影响。表明，ENO1在T19位点的O-GlcNAcylation通过增强有氧糖酵解来促进结直肠肿瘤生长。

③已有研究表明ENO1可增强与PD-L1的结合促进其与E3泛素连接酶STUB1的关联至其降解。基于AlphaFold2预测分析确定了位于相互作用界面的四个关键残基（N52、K54、K197和E250），发现E250A突变影响二者结合，S249糖基化可能破坏此结合。在不同细胞实验中，发现OGT过表达时，WT ENO1与PD-L1相互作用减弱，而S249A ENO1无明显变化，且OGT过表达不改变PD-L1 mRNA水平，表明是转录后调控。S249A ENO1重构细胞中PD-L1半衰期短，TMG处理促进WT ENO1重构细胞中PD-L1稳定性，但对S249A ENO1重构细胞无影响，蛋白酶体抑制剂MG132可挽救S249A ENO1重构细胞中PD-L1降解，表明S249 O-GlcNAc糖基化通过蛋白酶体降解途径抑制PD-L1表达。

03O-GlcNAcylation在CRC免疫逃逸和治疗中的作用

①ENO1的O-GlcNAcylation通过稳定PD-L1表达影响T细胞对肿瘤细胞的毒性。体外实验发现，调整S249A ENO1重构RKO细胞的PD-L1表达至与WT ENO1重构细胞相同后，二者增殖率类似，但前者与活化淋巴细胞共培养时细胞毒性更强，CD8+T细胞相关细胞因子分泌更多，恢复PD-L1表达后情况逆转，MC38细胞结果相似。

②体内实验中，不同MC38细胞系注入免疫缺陷裸鼠和免疫正常小鼠，免疫缺陷鼠中细胞系肿瘤生长无差异，免疫正常鼠中S249A ENO1细胞肿瘤生长减缓，相关指标改善，恢复PD-L1表达可反转变化，表明S249糖基化影响肿瘤浸润CD8+T细胞活性。转化相关性研究表明OGT抑制剂对WT ENO1细胞肿瘤生长有抑制作用，对S249A ENO1细胞无效。临床样本分析显示肿瘤组织中OGT和ENO1糖基化水平更高，且OGT与PD-L1及CD8+T细胞浸润正相关，说明ENO1 O-GlcNAcylation在CRC发展和免疫逃逸中有重要作用。

③研究测试了阻断ENO1在S249位点的O-GlcNAcylation是否能提高PD-L1抗体治疗的效果。实验中，将重组的MC38细胞（包括野生型和S249A突变型ENO1）注射到小鼠中，并在肿瘤形成后给予PD-L1抗体治疗。结果显示，PD-L1抗体治疗与ENO1 S249位点O-GlcNAcylation阻断的联合疗法比单独治疗更有效，能更显著地抑制肿瘤生长并延长小鼠生存期。此外，这种联合疗法还增加了肿瘤中CD8+T细胞的浸润，提高了IFN-γ和GZMB的水平，表明T细胞活性增强。