Significance and mechanism of mutually exclusive inactive histone marks

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ヒストンH3K27のトリメチル化（H3K27me3）とクロマチンにH3K9のトリメチル化（H3K9me3）の排他性を明らかにするために、H3K27me3が濃縮される場所にH3K9me3を導入する系を作製している。昨年度の研究で、ラパマイシンを用いた二量体化の誘導によりH3K27me3が濃縮される不活性X染色体上にH3K9me3を導入できることが明らかになった。また、その時間経過は比較的ゆっくりであったことから、必ずしも二量体化誘導系を用いる必要はないということがわかった。そこで、H3K27me3特異的細胞内抗体（H3K27me3-mintbody）にH3K9のトリメチル化酵素Suv39H2のメチル化活性(SET)ドメインを融合した蛋白質（H3K27me3-mintbody-Suv39H2(SET)）、及び、メチル化活性をもたないSETドメインの変異体（methyltransferase-deficient SET; dSET)を融合し蛋白質（H3K27me3-mintbody-Suv39H2(dSET)）をドキシサイクリン依存的に発現するマウス細胞株を樹立した。H3K27me3-mintbody-Suv39H2(SET)の発現をドキシサイクリンで誘導すると数時間後に蛍光が見られ、不活性X染色体上への局在も確認できた。現在、細胞の表現型の解析を進めている。生細胞でH3K9me3が濃縮する部位を可視化できるプローブに関しては、Suv420H2のヘテロクロマチン局在化ドメイン中のヘテロクロマチン蛋白質１（HP1）に結合部位を用いて開発を進めている。これまでの研究でN末端側のHP1結合モチーフを含む領域は結合力が強すぎて生細胞プローブに向かないことがわかったが、今回、C末端側の結合モチーフを含む領域が適度にHP1に結合すること示すことができた。このC末端側の30アミノ酸程度の領域は、生細胞中のクロマチン状態に影響を与えずに、HP1を介してH3K9me3の局在解析に使用できると考えられた。