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抗体エンジニアリングによるヒストン修飾シグナル可視化システムの開発

利用抗体工程开发组蛋白修饰信号可视化系统

基本信息

批准号：
19657060
负责人：
木村宏
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

ヒストンの翻訳後修飾は、エビジェネティックな遺伝子発現制御、DNA損傷修復、染色体の凝縮と分配などのゲノムの維持と発現に重要な役割を果たしている。しかし、その修飾を生きた細胞内でリアルタイムに観察することはほとんど行われていない。そこで、ヒストンの修飾が「いつ」、「どこで」起こるのかを系統的に明らかにするための実験手法を確立することを主な目的として、本研究を進めた。昨年度の研究で、ヒストンH3 Ser10のリン酸化(H3S10P)抗体などを産生するハイブリドーマから、IgGの重鎖と軽鎖をそれぞれクローニングし、GFP融合一本鎖可変領域抗体(GFP-scFv; green fluorescent protein fusion single-chin variable-region fragment)として培養細胞中での発現を試みた。しかしながら、ほとんどのGFP-scFVは細胞質中で凝集してしまい、染色体への結合は見られなかった。この要因として、可変領域の蛋白質の折りたたみが正常に行なわれないことやS-S結合が必要であることなどが考えられた。そこで、精製した修飾ヒストン抗体を蛍光標識し細胞に直接導入することで、その活性が細胞中でも保持されるかどうかを検討した。その結果、ほとんどの抗体は期待される局在を示したことから、抗体のエピトープへの結合能は細胞中でも維持されることが明らかになった。この精製抗体からFab(抗原結合断片)を調製し、同様に細胞に導入したところ、やはりそのエピトープへの結合能は保持されていた。従って、一旦適切に折りたたまれた重鎖と軽鎖が複合体を形成すると、細胞内環境でも安定にその構造が保持されると考えられた。今後は、ScFvではなく、Fabあるいは全長抗体としての発現を試み、ヒストン修飾のモニター系を開発したいと考えている。

DNA damage repair, chromosome condensation, chromosome distribution, chromosome maintenance and gene development are important services. In the cell, there is a change in the shape of a molecule. This study is intended to further the study of the relationship between the two groups. In the past year, the production of H3S10P antibody was tested in cultured cells, and the development of GFP-scFv (green fluorescent protein fusion single-chin variable-region fragment) was tested. GFP-scFV is aggregated in cytoplasm, and chromosome binding is observed. This is because the protein in the variable domain is normally bound to S-S binding. The antibody is introduced directly into the cell, and the activity is maintained in the cell. As a result, the antibody is expected to remain in the cell. The purified Fab(antigen-binding fragment) is modulated and introduced into the same cell, and the binding energy is maintained. The structure of the intracellular environment remains stable once the complex is formed properly. In the future, ScFv will be developed in the presence of full-length antibodies and Fab modifications.