マウスMCM関連タンパク質の解析

小鼠 MCM 相关蛋白分析

• 批准号: 06247201
• 负责人: 木村 宏
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06247201/
• 关键词: DNA複製; MCM遺伝子; MCM3; P1タンパク質; CDC46; Cdc21; 細胞周期; ライセンシングファクター

本年度の研究ではP1蛋白質を含むマウスMCM蛋白質の機能とその制御機構を明らかにするための基礎を築くことであった。本研究の成果は以下のとおりであり今後の機能解析へ向けてかなりの基礎的データを得ることができた。1.P1蛋白質と結合する90kDの蛋白質がマウスCDC46蛋白質であることを明らかにした。2.P1蛋白質が細胞周期に依存せず核に移行することを明らかにし、また、その核移行シグナルを同定した。CDC46蛋白質は核移行シグナルを持たないが、P1と結合することにより核に移行することが明らかになった。3.P1とCDC46は細胞周期を通じて常に結合すること、その結合には両蛋白質の全体的な構造が必要であることを明らかにした。また、CDC46はリン酸化を受けないことから、その核骨格との結合の制御にはP1のリン酸化が働いていることが推測された。4.大腸菌で発現させて精製したP1蛋白質を用いてマウス細胞抽出液によりin vitroでリン酸化反応を行い、in vivoのホスホペプチドマップと比較したところ、両者は比較的よく一致していた。このことから、P1蛋白質をリン酸化する酵素の同定が可能となった。5.大腸菌で様々な欠失変異体を作製し、in vitroでリン酸化反応を行いホスホペプチドマップを作製することによりP1蛋白質の少なくとも11あるリン酸化部位のうち4箇所の位置を推定できた。6.少なくとも大腸菌で発現させたP1蛋白質単独ではATPase活性は確認できなかった。7.マウスCdc21蛋白質の断片を大腸菌で発現させ、抗原とし、抗Cdc21抗体を作製した。その抗体を用いた免疫蛍光の結果から、Cdc21もP1やCDC46と同様に核に局在することが明らかになった。また、免疫沈降では、100kDのCdc21の他、80kDのMRP5(新規のマウスMCM蛋白質)、110kDおよび130kDの蛋白質が共沈した。これらのことから、MCM蛋白質は互いに結合し、巨大な蛋白質複合体を形成していることが明らかになった。

This year's study focused on P1 protein and MCM protein functions and regulatory mechanisms. The results of this study are as follows: functional analysis, basic analysis, and analysis. 1. P1 protein binds to CDC46 protein 2. The P1 protein is cell cycle dependent and the nuclear migration is constant. CDC46 protein nuclear migration, P1 binding, nuclear migration, 3. P1 and CDC46 are essential to the overall structure of the protein. CDC46 is the first to be acidified. 4. E. coli production and purification of P1 protein in vitro and in vivo The protein P1 was isolated from the protein P2 and the protein P3 was isolated from the protein P2. 5. The position of all four sites of the P1 protein was estimated. 6. A small number of E. coli strains were detected and P1 protein was isolated and ATPase activity was confirmed. 7. Cdc21 protein fragments were detected in E. coli, antigen and anti-Cdc21 antibody were produced. The results of antibody use are as follows: CDC21, CDC46, CDC28, CDC29, CDC29, CD Immuno-precipitation, 100 kD Cdc21 protein, 80 kD MRP 5 (new MCM protein), 110 kD Cdc21 protein, 130 kD protein. MCM proteins bind to each other and form giant protein complexes.