マウスMCM関連タンパク質の解析

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本年度の研究ではP1蛋白質を含むマウスMCM蛋白質の機能とその制御機構を明らかにするための基礎を築くことであった。本研究の成果は以下のとおりであり今後の機能解析へ向けてかなりの基礎的データを得ることができた。1.P1蛋白質と結合する90kDの蛋白質がマウスCDC46蛋白質であることを明らかにした。2.P1蛋白質が細胞周期に依存せず核に移行することを明らかにし、また、その核移行シグナルを同定した。CDC46蛋白質は核移行シグナルを持たないが、P1と結合することにより核に移行することが明らかになった。3.P1とCDC46は細胞周期を通じて常に結合すること、その結合には両蛋白質の全体的な構造が必要であることを明らかにした。また、CDC46はリン酸化を受けないことから、その核骨格との結合の制御にはP1のリン酸化が働いていることが推測された。4.大腸菌で発現させて精製したP1蛋白質を用いてマウス細胞抽出液によりin vitroでリン酸化反応を行い、in vivoのホスホペプチドマップと比較したところ、両者は比較的よく一致していた。このことから、P1蛋白質をリン酸化する酵素の同定が可能となった。5.大腸菌で様々な欠失変異体を作製し、in vitroでリン酸化反応を行いホスホペプチドマップを作製することによりP1蛋白質の少なくとも11あるリン酸化部位のうち4箇所の位置を推定できた。6.少なくとも大腸菌で発現させたP1蛋白質単独ではATPase活性は確認できなかった。7.マウスCdc21蛋白質の断片を大腸菌で発現させ、抗原とし、抗Cdc21抗体を作製した。その抗体を用いた免疫蛍光の結果から、Cdc21もP1やCDC46と同様に核に局在することが明らかになった。また、免疫沈降では、100kDのCdc21の他、80kDのMRP5(新規のマウスMCM蛋白質)、110kDおよび130kDの蛋白質が共沈した。これらのことから、MCM蛋白質は互いに結合し、巨大な蛋白質複合体を形成していることが明らかになった。