マウスP1タンパク質のリン酸化制御

小鼠P1蛋白的磷酸化调控

• 批准号: 07780589
• 负责人: 木村 宏
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07780589/
• 关键词: cell cycle; DNA replication; licensing factor; MCM3; mouse; nuclear localization signal; P1 protein; phosphorylation

MCMタンパク質は、細胞周期のM期の終了時にクロマチンと結合し、S期にDNA複製の進行に伴ってクロマチンから遊離することで、DNA複製が一度の細胞周期で唯一度だけ起こるための調節に関与している。出芽酵母MCM3がS期に核から細胞質へ移動するのに対し、そのホモログであるマウスP1/MCM3タンパク質はクロマチンから遊離しても核に局在する。しかしながら、クロマチンと結合したタンパク質に比べて遊離したP1/MCM3は、高度にリン酸化を受けている。そこで、P1/MCM3のリン酸化部位とそのリン酸化酵素の同定を試みた。大腸菌で作製したGST-P1/MCM3融合タンパク質を其質として、様々なリン酸化酵素を用いてリン酸化反応を行った。その結果、カゼインキナーゼ2(CKII)、DNA依存性プロテインキナーゼ(DNK-PK)、Cdc2/cyclin B、Cdc2/cyclin Aにより、P1/MCM3がリン酸化され、G1 cyclin/Cdkではリン酸化されなかった。今回、そのうちCKIIによるリン酸化部位は、bipartite型の核移行シグナルのスペーサー領域に存在することを突き止めた。実際、この部分のフォスフォペプチドマップはin vivoのリン酸化によるマップと一致しており、in vivoでもリン酸化されていると考えられた。そこで、そのリン酸化が核移行に影響を与えているかどうかを確かめるため、セリン及びスレオニンをアラニンに置換した変異体を作製し、トランスフェクションにより、その局在を観察した。その結果、変異体は核に局在し、核移行シグナル部分のCKIIによるリン酸化は、核への輸送に必要ではないということが明らかになった。また、DNA-PKによるリン酸化部位もP1/MCM3のC末端付近に存在することも明らかになり、そのリン酸化がクロマチンとの結合にどう影響するか興味が持たれる。

MCM タ ン パ ク は, by the end of the cell cycle phase の M の に ク ロ マ チ ン と し, S phase に DNA replication の に with っ て ク ロ マ チ ン か ら free す る こ と で once の cell cycle, DNA replication が で only degrees だ け up こ る た め の adjust に masato and し て い る. Budding yeast MCM3 が S period に nuclear か ら cytoplasm へ mobile す る の に し, seaborne そ の ホ モ ロ グ で あ る マ ウ ス P1 / MCM3 タ ン パ ク qualitative は ク ロ マ チ ン か ら free し て も nuclear に bureau in す る. し か し な が ら, ク ロ マ チ ン と combining し た タ ン パ ク qualitative に than べ て free し た P1 / MCM3 は, highly に リ ン acidification を by け て い る. Youdaoplaceholder0 を で, P1/MCM3 <s:1> リ <s:1> acidification site とそ リ リ <s:1> acidification enzyme <e:1> are determined to を test みた. Coliform で cropping し た GST fusion - P1 / MCM3 タ ン パ ク quality を its quality と し て, others 々 な リ ン を acidification enzyme with い て リ ン acidification anti 応 を line っ た. そ の results, カ ゼ イ ン キ ナ ー ゼ 2 (CKII), DNA dependency プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼ (DNK - PK), Cdc2 / cyclin B, Cdc2 / cyclin A に よ り, P1 / MCM3 が リ ン acidification さ れ, G1 cyclin/Cdk で は リ ン acidification さ れ な か っ た. Today, back そ の う ち CKII に よ る リ ン は acidification parts, bipartite nuclear migration の シ グ ナ ル の ス ペ ー サ に ー field exist す る こ と を tu き check め た. Be international, こ の part の フ ォ ス フ ォ ペ プ チ ド マ ッ プ は in vivo の リ ン acidification に よ る マ ッ プ と consistent し て お り, the in vivo で も リ ン acidification さ れ て い る と exam え ら れ た. そ こ で, そ の リ ン acidification が nuclear migration に influence を and え て い る か ど う か を か indeed め る た め, セ リ ン and び ス レ オ ニ ン を ア ラ ニ ン に replacement し た - variant を as し, ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン に よ り, そ の bureau in を 観 examine し た. そ の results, variations variants は nuclear に bureau in し, nuclear migration シ グ ナ ル part の CKII に よ る リ ン acidification は, nuclear へ の conveying に necessary で は な い と い う こ と が Ming ら か に な っ た. ま た, DNA - PK に よ る リ ン acidification parts も P1 / MCM3 の C end paying nearly に exist す る こ と も Ming ら か に な り, そ の リ ン acidification が ク ロ マ チ ン と の combining に ど う influence す る か tumblers が hold た れ る.

项目成果

Takizawa,N.,Kimura,H.,& Sugimoto,K.: "Sequence and expression of mouse CDC47,a member of the minichromosome maintenance (Mcm) family involved in the DNA replication licensing system" Gene. 167. 343-344 (1995)

泷泽，N.，木村，H.，

Yoshida,I.,Kimura,H.,&Takagi,N.: "The mouse Mcmd Gene for DNA Replication Protein P1MCM3 Maps to Bands A3-A5 on Chromosome 1 by Fluorescene in Situ Hybridization" Genomics. (in press). (1996)

吉田，I.，木村，H.，

Kimura,H.,Takizawa,N.,Nozaki,N. & Sugimoto,K.: "Molecular Cloning of cDNA encoding mouse Cdc21 and CDC46 homologs and characterization of the product:physical interaction between P1(MCM3)and CDC46 proteins" Nucleic Acids Reseach. 23. 2097-2104 (1995)

木村 H.、泷泽 N.、野崎 N.