生細胞内のRNAポリメラーゼII動態の計測

测量活细胞中的 RNA 聚合酶 II 动态

• 批准号: 10F00712
• 负责人: 木村 宏
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2010
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2010 至 2011
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10F00712/
• 关键词: 転写制御; RNAポリメラーゼ; 細胞核; 翻訳後修飾; エピジェネティクス; 遺伝子発現; 生細胞イメージング; FRAP

真核生物のRNAポリメラーゼIIは、遺伝子の転写を担う重要な酵素であり、十数個のサブユニットから構成される。生きた細胞の中で、RNAポリメラーゼがどのように転写開始、伸長、終結を行うのかを明らかにすることは、遺伝子発現制御を理解するうえで非常に重要である。これまでにもGFP融合蛋白質を用いてRNAポリメラーゼIIの生細胞における分子動態が解析されてきたが、個々の報告で異なるモデルと結果が得られておりその全容の解明には至っていない。本研究は、RNAポリメラーゼIIの状態に応じて付加される翻訳後修飾の違いを利用して、そのプロモータ上へのリクルート、転写開始、転写伸長の各ステップに至るキネティクスを明らかにするとともに、ヒストン修飾などクロマチン構造の変化と転写制御の関係を生きた細胞で明らかにすることを目的として行った。昨年度の研究で、Fabを用いた内在性RNAポリメラーゼII検出系を構築し、転写誘導に伴うRNAポリメラーゼIIの動態を計測した。本年度は、その計測結果の定量化を行った。また、ヒストンH3K27のアセチル化の変動も合わせて解析を行った。さらに、定量的ウェスタンブロッティングにより、細胞あたりのRNAポリメラーゼIIの総量と特定のリン酸化状態にある分子数を見積もった。そして、RNAポリメラーゼIIの集積、転写開始、転写伸長のキネティックモデルの構築とシミュレーションを行い、RNAポリメラーゼIIの数と生細胞計測により得られた集積曲線に最もよく適合する数値を導き出した。その結果、遺伝子のプロモータにリクルートされたRNAポリメラーゼIIが、転写開始に至るまでに、複数回の解離と結合を繰り返すこと、また、転写開始から伸長に至る過程は比較的効率が高いこと、また、ヒストンの脱アセチル化が新規転写を抑制する可能性があることなどが示唆された。

Eukaryotic RNA fragments are composed of several important enzymes. It is very important to understand the origin, development and control of RNA in cells. The GFP fusion protein was used to analyze the molecular dynamics of the recombinant protein in vitro. In this study, the status of RNA fragmentation II was analyzed, and the post-translational modification was utilized to determine the relationship between the development of RNA fragmentation II and the initiation, initiation, and elongation of RNA fragmentation. In this study, Fab was used to construct and measure the dynamics of endogenous RNA. This year, the quantitative analysis of measurement results was conducted. H3K27 is a new type of mobile phone. In addition, quantitative analysis of the number of RNA molecules in the cell and in the specific acid state can be done. For example, RNA aggregation curve, RNA elongation curve, RNA aggregation curve, RNA aggregation curve. The results show that the efficiency of the process comparison from the beginning to the end of the writing process is high, and the possibility of the process comparison from the beginning to the end is high.

项目成果

蛋白質翻訳後修飾の生細胞イメージング

蛋白质翻译后修饰的活细胞成像

• 发表时间: 2011
• 作者: 張雅素、焦爽、芳賀信彦;ほか;Timothy J.Stasevich;C.Thomas;Timothy J Stasevich;Timothy J Stasevich;木村宏
• 通讯作者: 木村宏

Timing the recruitment, initiation, and elongation of endogenous RNA polymerase II in single living cells

确定单个活细胞中内源性 RNA 聚合酶 II 的募集、起始和延伸时间

• 发表时间: 2011
• 作者: 張雅素、焦爽、芳賀信彦;ほか;Timothy J.Stasevich;C.Thomas;Timothy J Stasevich;Timothy J Stasevich;木村宏;Timothy J Stasevich
• 通讯作者: Timothy J Stasevich

Direct quantification of pol II recruitment, initiation, and elongation times in live cells

直接定量活细胞中 pol II 募集、起始和延伸时间

• 发表时间: 2010
• 作者: 張雅素、焦爽、芳賀信彦;ほか;Timothy J.Stasevich;C.Thomas;Timothy J Stasevich;Timothy J Stasevich;木村宏;Timothy J Stasevich;Timothy J Stasevich
• 通讯作者: Timothy J Stasevich

Visualizing live-cell epigenetic modifications of endogenous RNA polymerase II and histones at an activated gene array

在激活的基因阵列上可视化内源性 RNA 聚合酶 II 和组蛋白的活细胞表观遗传修饰

• 发表时间: 2012
• 作者: 張雅素、焦爽、芳賀信彦;ほか;Timothy J.Stasevich;C.Thomas;Timothy J Stasevich
• 通讯作者: Timothy J Stasevich

Visualizing the Transcription Cycle of RNA Polymerase II in Single Living Cells

可视化单个活细胞中 RNA 聚合酶 II 的转录周期

• 发表时间: 2011
• 作者: 張雅素、焦爽、芳賀信彦;ほか;Timothy J.Stasevich;C.Thomas;Timothy J Stasevich;Timothy J Stasevich
• 通讯作者: Timothy J Stasevich