プロテオーム解析に基づく抗血小板薬の薬効指標の確立および薬動力学解析

本研究では、血小板凝集能を変化させた多血小板血漿をADP刺激した後のプロテオーム解析を行い、血小板凝集能を定量的に反映するタンパク質を探索する。保存検体でも安定に存在する指標タンパクを見出すことにより、臨床現場において血小板凝集能を容易に評価できるようになる。また、抗血小板薬の薬動力学解析が可能になり、合理的な薬物投与設計が可能になる。血小板凝集カスケードの最下流では、CalpainによってTalinが切断され、生成したTalin-HeadがIntegrinαⅡbβ3に結合し、IntegrinαⅡbβ3の活性化が起こる。したがって、Talin-Headの生成量を分析することで、血小板凝集能を評価できる。まず、健常人から得た新鮮血液を用いて、遠心分離によりPRPを調製し、ADP添加により血小板を活性化した直後に還元アルキル化処理し、トリプシンで蛋白質を断片化し、Talin-Headに特異的なアミノ酸配列を検出できるLC-TOF MS条件を検討した。STVLQQQYNRに相当するMSシグナルを特異的なアミノ酸配列として選択できた。そして、合成ペプチドを用いてMSによる測定の条件を検討したところ、必要な濃度範囲で直線性が得られ、測定可能であることがわかった。また、その測定結果はウエスタンブロッティングによる測定と矛盾せず、ヒト検体を用いた検討が可能であることが示された。薬物による影響を検討するには動物実験が適当であり、ラットにおけるTalin特異的配列を同定した。測定条件の検討をほぼ完了し、ヒトと同様の手法で測定可能となる見込みである。現時点で特に問題は生じていない。

本研究では、血小板凝集能を変化させた多血小板血漿をADP刺激した後のプロテオーム解析を行い、血小板凝集能を定量的に反映するタンパク質を探索する。保存検体でも安定に存在する指標タンパクを見出すことにより、臨床現場において血小板凝集能を容易に評価できるようになる。また、抗血小板薬の薬動力学解析が可能になり、合理的な薬物投与設計が可能になる。血小板凝集カスケードの最下流では、CalpainによってTalinが切断され、生成したTalin-HeadがIntegrinαⅡbβ3に結合し、IntegrinαⅡbβ3の活性化が起こる。したがって、Talin-Headの生成量を分析することで、血小板凝集能を評価できる。まず、健常人から得た新鮮血液を用いて、遠心分離によりPRPを調製し、ADP添加により血小板を活性化した直後に還元アルキル化処理し、トリプシンで蛋白質を断片化し、Talin-Headに特異的なアミノ酸配列を検出できるLC-TOF MS条件を検討した。STVLQQQYNRに相当するMSシグナルを特異的なアミノ酸配列として選択できた。そして、合成ペプチドを用いてMSによる測定の条件を検討したところ、必要な濃度範囲で直線性が得られ、測定可能であることがわかった。また、その測定結果はウエスタンブロッティングによる測定と矛盾せず、ヒト検体を用いた検討が可能であることが示された。薬物による影響を検討するには動物実験が適当であり、ラットにおけるTalin特異的配列を同定した。測定条件の検討をほぼ完了し、ヒトと同様の手法で測定可能となる見込みである。現時点で特に問題は生じていない。