フローサイトメトリーを用いた細胞外小胞の１粒子解析

細胞が分泌する直径30-150 nmの細胞外小胞（sEV）は細胞間情報伝達や代謝物の排出を行っており、様々な疾患の進行に関わっていることからsEVの検出による疾患診断法の確立が期待されている。疾患の早期診断や正確診断のためにはレアポピュレーションの検出と複数分子の検出に優位性があるフローサイトメーターを利用した一粒子解析が有用と考えられる。本研究では、フローサイトメーターを用いたsEV表面タンパク質、脂質、sEV内包microRNA（miRNA）解析技術を確立し、がん診断法に資する解析法の確立を目指す。これまでに１粒子解析が可能であるかの検証、タンパク質染色法の確立、脂質染色法の確立を完了しており、2022年度は定量解析法の確立、多様な細胞での解析を実施した。定量解析法の確立は、フローサイトメーターNanoFCMを用いて標準ビーズを用いた補正によるsEV粒子数の算出をおこなった。NanoFCMで得られた粒子濃度はNTA法で得られた粒子濃度と比較したところ、NanoFCMの方が若干高い粒子濃度を示す傾向にあった。これはNanoFCMが微小な粒子まで検出可能であることによると考えられる。多様な細胞での解析では、これまで使用してきた293T細胞由来sEVだけでなく、異なる口腔がん患者由来細胞OSC-20、HOC313、OSC-19細胞が分泌したsEVのPD-L1発現量を解析した。その結果、OSC-19細胞のsEVはPD-L1陽性sEVが約5%存在したが、その他の細胞のsEVではPD-L1陽性sEVは2%以下であった。以上のように、フローサイトメーターを用いたsEV解析に必要な、sEV上のタンパク質、脂質の定性解析および粒子数の定量解析が可能となり、多様な細胞が分泌するsEVを定性的に解析可能となった。

細胞が分泌する直径30-150 nmの細胞外小胞（sEV）は細胞間情報伝達や代謝物の排出を行っており、様々な疾患の進行に関わっていることからsEVの検出による疾患診断法の確立が期待されている。疾患の早期診断や正確診断のためにはレアポピュレーションの検出と複数分子の検出に優位性があるフローサイトメーターを利用した一粒子解析が有用と考えられる。本研究では、フローサイトメーターを用いたsEV表面タンパク質、脂質、sEV内包microRNA（miRNA）解析技術を確立し、がん診断法に資する解析法の確立を目指す。これまでに１粒子解析が可能であるかの検証、タンパク質染色法の確立、脂質染色法の確立を完了しており、2022年度は定量解析法の確立、多様な細胞での解析を実施した。定量解析法の確立は、フローサイトメーターNanoFCMを用いて標準ビーズを用いた補正によるsEV粒子数の算出をおこなった。NanoFCMで得られた粒子濃度はNTA法で得られた粒子濃度と比較したところ、NanoFCMの方が若干高い粒子濃度を示す傾向にあった。これはNanoFCMが微小な粒子まで検出可能であることによると考えられる。多様な細胞での解析では、これまで使用してきた293T細胞由来sEVだけでなく、異なる口腔がん患者由来細胞OSC-20、HOC313、OSC-19細胞が分泌したsEVのPD-L1発現量を解析した。その結果、OSC-19細胞のsEVはPD-L1陽性sEVが約5%存在したが、その他の細胞のsEVではPD-L1陽性sEVは2%以下であった。以上のように、フローサイトメーターを用いたsEV解析に必要な、sEV上のタンパク質、脂質の定性解析および粒子数の定量解析が可能となり、多様な細胞が分泌するsEVを定性的に解析可能となった。