Role and clinical application of exosome in corneal transplantation

外泌体在角膜移植中的作用及临床应用

基本信息

批准号：
21K09730
负责人：
山上聡
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Nihon University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K09730/
关键词：
エクソソーム角膜実質細胞角膜移植拒絶反応

项目摘要

角膜移植術後の拒絶反応制御は角膜移植のドナー角膜の生着に最も重要である。角膜移植後のドナー角膜の抗原認識は、抗原の直接認識・間接認識様式で行われていることは明らかだが、実際にドナー角膜の抗原情報が何によって転送されているかは不明であった。近年細胞間の情報伝達に細胞外小胞の一種であるエクソソームが関与しており、このエクソソームが細胞の変異、腫瘍細胞の免疫寛容性の獲得などに重要な役割を果たしていることが明らかになっている。そこで本研究では、ドナー角膜由来のエクソソームが角膜移植後のシグナル伝達に果たす役割を明らかにすることを目的とした検討を行った。まずエクソソームの効率のよい回収法を検討した。マウス角膜実質をエクソプラント法で初代培養し、P1細胞を10cmディッシュで培養しコンフルエントの状態で上清を採取し、ポリマー沈殿法、超遠心分離法、表面抗原アフィニティー法、ホスファチジルセリンアフィニティー法でエクソソームの回収を試みた。ホスファチジルセリンアフィニティー法でもっとも回収率、純度とも良好であったので、検討はすべてホスファチジルセリンアフィニティー法で実施することとした。次に混合リンパ球培養試験でエクソソームによる感作が成立するか否かを検討した。BALB/c の脾細胞を溶血しシングルセル作製し、１well当たり500000のBALB/cの脾細胞を用意した。C57BL/6の培養角膜実質細胞のウエルにBALB/c由来の脾細胞を混合したものをコントロールとし、あらかじめC57BL/6由来培養角膜実質由来エクソソーム添加したものと、XTT細胞増殖アッセイで細胞増殖能の違いを検討した。結果としてエクソソームを反応させた群で有意に強い細胞増殖反応を示したことから、エクソソームが細胞の感作に貢献していることが明らかとなった。

角膜植入后控制排斥反应对于角膜移植中的供体角膜植入最为重要。显然，角膜移植后供体角膜中的抗原识别以直接和间接的抗原识别方式发生，但尚不清楚实际上是什么实际传递了供体角膜的抗原信息。近年来，外泌体是一种细胞外囊泡，已经参与了细胞之间的信息传播，并且已经发现这些外泌体在细胞突变中起着重要作用，并且在肿瘤细胞中获得免疫耐受性。因此，进行这项研究的目的是阐明从供体角膜在角膜移植后信号传导中衍生的外泌体的作用。首先，我们研究了一种恢复外泌体的有效方法。将小鼠角膜基质使用源源培养，在10 cm的盘中培养P1细胞，并在汇合状态中收集上清液，并尝试使用聚合物沉淀，超级分解，表面抗原亲和力和磷脂酰丝氨酸亲和力收集外泌体。由于磷脂酰丝氨酸亲和力方法显示出最佳的回收率和纯度，因此使用磷脂酰丝氨酸亲和方法进行了所有研究。接下来，使用混合淋巴细胞培养试验来确定是否实现了外泌体的敏化。将BALB/C的脾细胞溶血以形成单细胞，每孔制备500,000个BALB/C脾细胞。通过将C57BL/6的培养的角膜薄壁组织中的BAL/C衍生外泌体的脾细胞混合到C57BL/6培养的角膜实质的孔中，并通过XTTT细胞增殖分析研究了细胞增殖能力的差异。结果，对外泌体反应的组显示出明显更强的细胞增殖反应，表明外泌体有助于细胞敏化。