外分泌細胞における余剰分泌顆粒の安全な処理機構としてのクリノファジーの役割

唾液腺腺房細胞における分泌顆粒の処理機構を解析するために，唾液タンパク質であるシスタチンD（Cst5）とHaloTagとの融合タンパク質（Cst5-Halo）を耳下腺初代培養細胞に発現させ，細胞内半減期の測定を行った。Cst5-Haloを発現した細胞をHaloTag TMRリガンドでラベルした後，未結合リガンドを除去し，0-8時間培養を行った。細胞を回収し，残存するTMRラベルされたCst5-Haloの量の変化を測定したところ，細胞内半減期は約３時間であった。次に，形成されてから時間が経過した分泌顆粒と新規に形成された顆粒の細胞内動態の違いを解析するために，Cst5-Haloを発現した唾液腺初代培養細胞をTMRリガンドでラベル後，未結合のリガンドを除去し3-24時間培養した。その後，Oregon Greenリガンドでラベルして，新旧の分泌顆粒の染め分けを試みた。時間経過と共にOregon Green 陽性の分泌顆粒は増えたが，24時間後でもTMRでラベルされた分泌顆粒が観察された。唾液腺の分泌顆粒はβアドレナリン受容体刺激で開口放出が促進される。新旧の分泌顆粒の分泌能を調べるために，TMRリガンドでラベルした後，未結合リガンドを除去し，3-6時間培養してからβアゴニストであるイソプロテレノール非存在下および存在下でインキュベートした。細胞と培地を回収しAlexaFluor 660リガンドでラベル後，電気泳動してゲルイメージングでそれぞれの色素でラベルされたCst5-Haloの分泌量を求めた。その結果，TMRラベルされたCst5-HaloはAlexaFluor 660ラベルされたCst5-Haloよりも非刺激時の分泌量が高かった。したがって，古くなった分泌顆粒は分泌刺激による制御を受けにくくなっていることが予想された。

唾液腺腺房細胞における分泌顆粒の処理機構を解析するために，唾液タンパク質であるシスタチンD（Cst5）とHaloTagとの融合タンパク質（Cst5-Halo）を耳下腺初代培養細胞に発現させ，細胞内半減期の測定を行った。Cst5-Haloを発現した細胞をHaloTag TMRリガンドでラベルした後，未結合リガンドを除去し，0-8時間培養を行った。細胞を回収し，残存するTMRラベルされたCst5-Haloの量の変化を測定したところ，細胞内半減期は約３時間であった。次に，形成されてから時間が経過した分泌顆粒と新規に形成された顆粒の細胞内動態の違いを解析するために，Cst5-Haloを発現した唾液腺初代培養細胞をTMRリガンドでラベル後，未結合のリガンドを除去し3-24時間培養した。その後，Oregon Greenリガンドでラベルして，新旧の分泌顆粒の染め分けを試みた。時間経過と共にOregon Green 陽性の分泌顆粒は増えたが，24時間後でもTMRでラベルされた分泌顆粒が観察された。唾液腺の分泌顆粒はβアドレナリン受容体刺激で開口放出が促進される。新旧の分泌顆粒の分泌能を調べるために，TMRリガンドでラベルした後，未結合リガンドを除去し，3-6時間培養してからβアゴニストであるイソプロテレノール非存在下および存在下でインキュベートした。細胞と培地を回収しAlexaFluor 660リガンドでラベル後，電気泳動してゲルイメージングでそれぞれの色素でラベルされたCst5-Haloの分泌量を求めた。その結果，TMRラベルされたCst5-HaloはAlexaFluor 660ラベルされたCst5-Haloよりも非刺激時の分泌量が高かった。したがって，古くなった分泌顆粒は分泌刺激による制御を受けにくくなっていることが予想された。