耳下腺腺房細胞においてVAMP-2と相互作用するタンパク質の検索

寻找腮腺腺泡细胞中与 VAMP-2 相互作用的蛋白质

• 批准号: 09771550
• 负责人: 吉垣 純子
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Nihon University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09771550/
• 关键词: 分泌; 唾液腺; cAMP; 開口放出; 分泌顆粒

本研究では,耳下腺腺房細胞におけるcAMP依存的なアミラーゼ分泌の分子機構の解明を目的として,SNAREタンパク質のひとつであるVAMP2の機能発現メカニズムについて解析を行った。そのために,VAMP2にたいする抗体anti-SER4256を作製し,免疫沈降によって腺房細胞内におけるVAMP2の状態を調べることにした。ラット耳下腺腺房細胞から分泌顆粒膜を単離し,可溶化後,免疫沈降を行った。すると,可溶化成分にVAMP2が含まれているにも関わらず,VAMP2の沈降は見られなかった。それに対して,可溶化分泌顆粒膜画分に細胞質画分およびcAMPを反応させた後,免疫沈降を行うと,VAMP2の沈降が確認された。この効果は,cAMP依存性プロテインキナーゼ(PKA)の特異的な阻害剤であるH89によって阻害された。また,cAMPのかわりに,PKAの触媒サブユニットを加えた場合にもVAMP2の沈降が見られ,PKAの活性化が,anti-SER4256によるVAMP2の免疫沈降に必要であることが示された。これらのことから,VAMP2は,刺激をしない状態では何らかのタンパク質と結合しており,それにより抗体がVAMP2と結合できない状態にあると考えられる。anti-SER4256によるVAMP2上の認識部位は,t-SNAREとの相互作用に必須であることが報告されており,PKAの活性化を介してこの部位が露出することによって,はじめてVAMP2とt-SNAREとの結合が可能になると予測される。また,PKAの触媒サブユニットだけではVAMP2の免疫沈降が起きず,細胞質が必要なことや,PKAによってリン酸化されることが必要なのは,細胞質画分であることが明らかになった。したがって,細胞質に存在する何らかのタンパク質のリン酸化を介して,VAMP2のt-SNARE結合部位の露出が引き起こされると考えられる。

The purpose of this study was to elucidate the molecular mechanisms of cAMP-dependent secretion in auricular gland cells and to elucidate the functional development of VAMP2 in SNARE. The antibody anti-SER4256 was used to inhibit VAMP2 expression, and the status of VAMP2 was modulated by immunoprecipitation in glandular cells. The secretory granular membrane of the auricular gland cells is separated and solubilized, and the immune sedimentation is performed. The soluble component VAMP2 is contained in the solution, and the precipitation of VAMP2 is observed. In response, the solubilized secretory granule membrane was isolated from the cytoplasm and cAMP was detected by immunoprecipitation. As a result, cAMP-dependent protein expression (PKA) is a specific inhibitor of H89. In addition to cAMP,PKA is a catalyst for VAMP2 precipitation, PKA activation,anti-SER4256, VAMP2 immune precipitation is necessary. VAMP2 is in the state of stimulation and binding. VAMP2 is in the state of binding. Anti-SER4256: The recognition site on VAMP2 is required for t-SNARE interaction. The activation site of PKA is exposed. The t-SNARE binding site of VAMP2 is predicted. PKA is a catalyst for VAMP2. It is necessary for PKA to be acidified. It is necessary for PKA to be purified. The presence of cytosol and the presence of protein in the cytoplasm are mediated by the presence of t-SNARE binding sites of VAMP2.

项目成果

Dohke,Y., Hara-Yokoyama,M. Fujita-Yoshigaki,J. et al.: "ADP-ribosylation factors in rat parotid acinar cells." European Journal of Morphology. 36. 186-189 (1998)

Dohke，Y.，原横山，M.

Sugiya,H., Michikawa,H., Mitsui,Y., Fujita-Yoshigaki,J. et al.: "Ca^<2+>-nitiric oxide-cGMP signaling in rabbit parotid acinar cells." European Journal of Morphology. 36. 194-197 (1998)

杉谷，H.，道川，H.，三井，Y.，藤田吉垣，J.

Fujita-Yoshigaki,J.: "Divergence and convergence in regulated exocytosis: The characteristics of cAMP-dependent enzyme secretion of parotid salivary acinar cells." Cellular Signaling. 10(6). 371-375 (1998)

Fujita-Yoshigaki, J.：“调节胞吐作用的发散和收敛：腮腺唾液腺泡细胞 cAMP 依赖性酶分泌的特征。”

Michikawa,H., Mitsui,Y., Fujita-Yoshigaki,J. et al.: "cGMP production is coupled to Ca^<2+>-dependent nitric oxide generation in rabbit parotid" Cell Calcium. 23(6). 405-412 (1998)

道川，H.，三井，Y.，藤田吉垣，J.

吉垣 純子: "Divergence and convergence in regulated exocytosis:The characteristics of cAMP-dependent enzyme secretion of parotid salivary acinar cells." Cellular Singnaling. 10(in press). (1998)

Junko Yoshigaki：“调节胞吐作用的分歧和收敛：腮腺唾液腺细胞的 cAMP 依赖性酶分泌特征。”细胞信号传导 10（出版中）。