Unraveling of mechanisms of functional cluster formation of glycolipids and verification of the hierarchical structure by high-resolution single-molecule imaging

通过高分辨率单分子成像揭示糖脂功能簇形成机制并验证分级结构

• 批准号: 21H02424
• 负责人: 鈴木 健一
• 金额: $ 11.15万
• 依托单位: Gifu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21H02424/
• 关键词: 1分子観察; ガングリオシド; 脂質ラフト; シグナル伝達; 膜受容体; 糖脂質; GPIアンカー型タンパク質; 細胞膜ドメイン; ラフト; １分子観察; 超解像顕微鏡法

本研究では、高精度1分子・超解像顕微鏡観察技術に基づき、生細胞膜上で糖脂質は糖鎖間相互作用により、GPIアンカー型タンパク質は細胞外タンパク質間相互作用により、機能性集合体を誘起し、ラフト脂質がそれを安定化するという概念を検証する。さらに、このような複合体自体を集める大きな膜領域（階層構造）が存在するかを検証する。もし、階層構造がある場合は、その形成機構を明らかにすることを目的としている。今まで、糖脂質ガングリオシド蛍光プローブがなかったために、生細胞膜上の糖脂質ガングリオシドの動態研究は皆無であった。しかし、我々は8種のガングリオシド蛍光プローブを開発し、上記課題に挑んだ。昨年度、様々なGPIアンカー型タンパク質の超解像ライブセルイメージングを行った。同種のGPIアンカー型タンパク質ドメイン間の共局在は、タンパク質相互作用がある分子は顕著だったが、タンパク質相互作用のない分子では、稀であった。一方、コレステロール除去後のGPIアンカー型タンパク質やGPIアンカー鎖を非ラフトの貫通型タンパク質に変えたキメラでは、同種分子のドメイン間の共局在が激減していた。さらに膜内層のPSやPI(4,5)P2といった脂質分子の結合タンパク質の超解像ライブセルイメージングを行った。膜内層脂質がアクチン膜骨格に結合時、内層脂質とGPIアンカー型タンパク質ドメインとの共局在強度が大きく増加した。一方、膜貫通型のキメラタンパク質は、内層脂質がアクチンに結合してもしなくても有意に違いが見られなかった。これらの結果は、側方方向のタンパク質相互作用がドメイン同士の共局在を誘起し、脂質相互作用が安定化していることを示唆している。さらに、膜ドメインとアクチン結合した内層脂質のドメイン間の共局在が見られたことは、膜表裏の脂肪酸同士のカップリングによっても、ドメイン形成が安定化されていることを示唆している。

在这项研究中，基于高精度单分子的超分辨率显微镜观察技术，我们研究了糖脂通过糖基化相互作用诱导活细胞膜上的功能组件的概念，而GPI-Chandor蛋白质通过外蛋白质相互作用和Raftim lipids稳定它们来诱导功能组件。此外，还可以验证是否有大型膜区域（分层结构）收集这种复合物本身。如果有层次结构，目的是阐明形成的机理。到目前为止，尚未进行糖脂神经节苷脂的荧光探针，并且尚未就活细胞膜上的糖脂神经节苷脂的动力学进行研究。但是，我们开发了八个神经节荧光探针，并解决了上述挑战。去年，我们对各种GPI锚定蛋白进行了超分辨率的活细胞成像。同源GPI锚定蛋白结构域之间的共定位对于具有蛋白质相互作用的分子而言是突出的，但对于没有蛋白质相互作用的分子而言，很少见。另一方面，在去除胆固醇后，将GPI锚蛋白和GPI锚固链转化为非抗抗穿透蛋白的嵌合体中，同种异体分子的结构域之间的共定位大大降低。此外，进行了脂质分子结合蛋白（如PS和PI（4,5）P2）的超分辨率活细胞成像。当膜脂质与肌动蛋白膜骨架结合时，膜脂质的共定位强度和GPI锚定蛋白结构域显着增加。另一方面，在跨膜嵌合蛋白中均未观察到任何与肌动蛋白结合的内脂质的显着差异。这些结果表明，横向蛋白相互作用诱导域的共定位并稳定脂质相互作用。此外，膜结构域与肌动蛋白结合衬里脂质的结构域之间的共定位表明，通过在膜的前后脂肪酸偶联来稳定结构域的形成。

项目成果

Formation of Supramolecular Nanostructures through in Situ Self‐Assembly and Post‐Assembly Modification of a Biocatalytically Constructed Dipeptide Hydrazide

通过生物催化构建的二肽酰肼的原位自组装和组装后修饰形成超分子纳米结构

• DOI: 10.1002/chem.202104421
• 发表时间: 2022
• 期刊: Chemistry A European Journal
• 作者: Shintani Yuki;Ohtomi Taku;Shibata Aya;Kitamura Yoshiaki;Hirosawa Koichiro M.;Suzuki Kenichi G. N.;Ikeda Masato
• 通讯作者: Ikeda Masato

２色同時超解像動画観察によるGPI-アンカー型タンパク質の膜ドメイン形成機 構の解明

通过双色同时超分辨率视频观察阐明GPI锚定蛋白的膜域形成机制

• 发表时间: 2022
• 作者: 川合登偉;笠井倫志;廣澤幸一朗;横田康成;鈴木健一
• 通讯作者: 鈴木健一

細胞外小胞を介したWnt のシグナル伝達機構の解明

通过细胞外囊泡阐明 Wnt 信号转导机制

• 发表时间: 2022
• 作者: 笠井倫志;鈴木健一
• 通讯作者: 鈴木健一

Construction of a Reduction‐responsive DNA Microsphere using a Reduction‐cleavable Spacer based on a Nitrobenzene Scaffold

使用基于硝基苯支架的还原可裂解间隔基构建还原响应 DNA 微球

• DOI: 10.1002/asia.202200142
• 发表时间: 2022
• 期刊: Chemistry An Asian Journal
• 作者: Higashi Sayuri L.;Isogami Ayaka;Takahashi Junko;Shibata Aya;Hirosawa Koichiro M.;Suzuki Kenichi G.N.;Sawada Shunsuke;Tsukiji Shinya;Matsuura Kazunori;Ikeda Masato
• 通讯作者: Ikeda Masato

Regulation mechanisms of EGFR activation by gangliosides as revealed by single-molecule imaging

单分子成像揭示神经节苷脂激活EGFR的调控机制

• 发表时间: 2022
• 作者: 大塚里美;吉田朱里;波多野直哉;奥村太晟;澤直樹;田邊史子;傳田美和子;金山直樹;曲正樹;森下了;石川彰彦;徳光浩;Hiroshi Sugimoto;Kenichi G. N. Suzuki
• 通讯作者: Kenichi G. N. Suzuki