Unraveling of mechanisms of functional cluster formation of glycolipids and verification of the hierarchical structure by high-resolution single-molecule imaging

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本研究では、高精度1分子・超解像顕微鏡観察技術に基づき、生細胞膜上で糖脂質は糖鎖間相互作用により、GPIアンカー型タンパク質は細胞外タンパク質間相互作用により、機能性集合体を誘起し、ラフト脂質がそれを安定化するという概念を検証する。さらに、このような複合体自体を集める大きな膜領域（階層構造）が存在するかを検証する。もし、階層構造がある場合は、その形成機構を明らかにすることを目的としている。今まで、糖脂質ガングリオシド蛍光プローブがなかったために、生細胞膜上の糖脂質ガングリオシドの動態研究は皆無であった。しかし、我々は8種のガングリオシド蛍光プローブを開発し、上記課題に挑んだ。昨年度、様々なGPIアンカー型タンパク質の超解像ライブセルイメージングを行った。同種のGPIアンカー型タンパク質ドメイン間の共局在は、タンパク質相互作用がある分子は顕著だったが、タンパク質相互作用のない分子では、稀であった。一方、コレステロール除去後のGPIアンカー型タンパク質やGPIアンカー鎖を非ラフトの貫通型タンパク質に変えたキメラでは、同種分子のドメイン間の共局在が激減していた。さらに膜内層のPSやPI(4,5)P2といった脂質分子の結合タンパク質の超解像ライブセルイメージングを行った。膜内層脂質がアクチン膜骨格に結合時、内層脂質とGPIアンカー型タンパク質ドメインとの共局在強度が大きく増加した。一方、膜貫通型のキメラタンパク質は、内層脂質がアクチンに結合してもしなくても有意に違いが見られなかった。これらの結果は、側方方向のタンパク質相互作用がドメイン同士の共局在を誘起し、脂質相互作用が安定化していることを示唆している。さらに、膜ドメインとアクチン結合した内層脂質のドメイン間の共局在が見られたことは、膜表裏の脂肪酸同士のカップリングによっても、ドメイン形成が安定化されていることを示唆している。