Interaction of sperm protease with egg extracellular matrix and its application to reproduction technology

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前年度までの研究から、S2細胞で分泌発現させたブタアクロシンでは、低分子基質での酵素活性と、SDS-PAGEゲル内でのミルクカゼインをタンパク質基質にした場合の酵素活性は測定できたが、親水性小分子量タンパク質MBP(maltose-binding protein)と融合したZPタンパク質を基質した場合には分解活性は認められなかった。そこでS2細胞で発現させる際に、アクロシンとZPの発現コンストラクトDNAを混合して同時にS2細胞に添加して形質転換することで、同一細胞内でアクロシンとZPタンパク質を一緒に発現させ、ゴルジや分泌小胞などの細胞内小胞の内部でアクロシンとZPタンパク質を遭遇させて高濃度の状態で酵素反応をさせるモデル実験系を試みた。ブタZPsを単独で発現させると、それぞれの融合タンパク質に相当する75 kDa前後の分子量のMBP-ZP2、MBP-ZP3およびMBP-ZP4のバンドが明確に検出でき、S2培養細胞での分泌発現では内因性のプロテアーゼで分解されることなくインタクトな状態で分泌発現することが明らかとなった。そこで、MBP-ZPsのそれぞれの発現コンストラクトとブタアクロシンの発現コンストラクトを混合してS2細胞に導入して分泌発現させた。培養上清のMBP-ZPsをMBPに対する抗体で検出するSDS-PAGE・免疫ブロットで解析した結果、MBP-ZP2では約50 kDaの、またMBP-ZP3とMBP-ZP4では約57 kDaの分解断片が検出された。MBP単体では約40kDaで全く分解されていないことから、それぞれのZPタンパク質を構成するドメイン（ZPNおよびZPCドメイン）を繋ぐリンカー領域が選択的に切断されている可能性が考えられた。また、断片化されたバンドと未分解のバンドの強度の比較から、MBP-ZP2が優先的に切断されていることが示唆された。