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Interaction of sperm protease with egg extracellular matrix and its application to reproduction technology

精子蛋白酶与卵细胞外基质的相互作用及其在生殖技术中的应用

基本信息

批准号：
20H02949
负责人：
松田幹
金额：
$ 8.74万
依托单位：
Fukushima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度までの研究から、S2細胞で分泌発現させたブタアクロシンでは、低分子基質での酵素活性と、SDS-PAGEゲル内でのミルクカゼインをタンパク質基質にした場合の酵素活性は測定できたが、親水性小分子量タンパク質MBP(maltose-binding protein)と融合したZPタンパク質を基質した場合には分解活性は認められなかった。そこでS2細胞で発現させる際に、アクロシンとZPの発現コンストラクトDNAを混合して同時にS2細胞に添加して形質転換することで、同一細胞内でアクロシンとZPタンパク質を一緒に発現させ、ゴルジや分泌小胞などの細胞内小胞の内部でアクロシンとZPタンパク質を遭遇させて高濃度の状態で酵素反応をさせるモデル実験系を試みた。ブタZPsを単独で発現させると、それぞれの融合タンパク質に相当する75 kDa前後の分子量のMBP-ZP2、MBP-ZP3およびMBP-ZP4のバンドが明確に検出でき、S2培養細胞での分泌発現では内因性のプロテアーゼで分解されることなくインタクトな状態で分泌発現することが明らかとなった。そこで、MBP-ZPsのそれぞれの発現コンストラクトとブタアクロシンの発現コンストラクトを混合してS2細胞に導入して分泌発現させた。培養上清のMBP-ZPsをMBPに対する抗体で検出するSDS-PAGE・免疫ブロットで解析した結果、MBP-ZP2では約50 kDaの、またMBP-ZP3とMBP-ZP4では約57 kDaの分解断片が検出された。MBP単体では約40kDaで全く分解されていないことから、それぞれのZPタンパク質を構成するドメイン（ZPNおよびZPCドメイン）を繋ぐリンカー領域が選択的に切断されている可能性が考えられた。また、断片化されたバンドと未分解のバンドの強度の比較から、MBP-ZP2が優先的に切断されていることが示唆された。

Previous year's research results, S2 cell secretion test results, low molecular matrix enzyme activity test results, SDS-PAGE internal test resultsクカゼインをタンパクMaterial matrix にしたのEnzyme activity measurement できたが, hydrophilic small molecular weight タンパク MBP (maltose-binding Protein) and the fusion of the ZP タンパクsubstrate and the occasion には decomposition activity は recognized められなかった.そこでS2 cell で発appears させるinteriorに, アクロシンとZP の発appears コンストラクトDNAをmix Combined and added S2 cells at the same time, morphological change of S2 cells, ZP in the same cellタンパク性を一 thread に発appears させ、ゴルジやSecretory cell などの inner cell でアクロシンとZP タンパクqualityをencounters させてhigh-concentrationstateでenzymereactionをさせるモデル実験System をtrialみた.ブタZPsを単多で発appearsさせると、それぞれのfusion タンパクqualityに considerableする75 MBP-ZP2, MBP-ZP3, MBP-ZP4, MBP-ZP4, MBP-ZP2 and MBP-ZP4 molecular weights before and after kDa are clear and S2 cultured cellsでのSecretory syndrome では Endogenous のプロテアーゼでdegradation されることなくインタクトなSTATE secretion発appearすることが明らかとなった.そこで、MBP-ZPsのそれぞれの発成コンストラクトとブタアクロシThe ンの発appears and the コンストラクトを mix is introduced into the S2 cells and the して secretes the 発appears and it is introduced. MBP-ZPs of the culture supernatant was analyzed using SDS-PAGE and immune analysis of MBP antibodies, and the result was about 50 for MBP-ZP2. kDaの、MBP-ZP3とMBP-ZP4ではAbout 57 kDa decomposed fragmentsが検出された. MBP monomer is about 40kDa, it is fully decomposed, it is decomposed, it is composed of ZP, it is composed ofイン (ZPN およびZPC ドメイン) を system ぐリンカー eld が选択に cut off されている possibility が考えられた.また, Fragmented されたバンドとUndecomposed のバンドのStrength のComparative から, MBP-ZP2 がThe に cut されていることが Show 唆された.