発がんシグナル誘導性複製ストレスへの応答機構を標的とする治療開発

针对致癌信号诱导的复制应激的反应机制的治疗开发

基本信息

批准号：
19K07772
负责人：
山下孝之
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Gunma University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-01 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

がん遺伝子の活性化はDNA損傷を介してゲノム不安定性を促進する一方、細胞の老化・死を引き起こす。したがって、この仕組みの解明は発がん過程の理解だけでなく治療の開発にも重要である。ゲノムには、一本鎖DNAがG4と呼ばれる二次構造を形成しうるモチーフが37万以上あると推定される。グアニン四重鎖構造(G4)はDNA複製に対する障壁となるが、がん遺伝子活性化が誘導するDNA損傷における役割は明らかではない。本研究では、がん遺伝子誘導性DNA損傷におけるG4の役割を解明することを目的として、複数のヒト細胞株(U2OS, Tert-RPE1, HeLaなど)にER-Myc融合遺伝子を安定的に発現するクローンを作成した。これらの細胞株を4OHTによって処理するとMycが活性化され、DNA損傷を伴う細胞周期の停止や細胞死の誘導が観察された。G4を特異的に認識するモノクローナル抗体(BG4)を用いて核内DNAのG4構造を染色したところ、いずれの細胞においても4OHT処理によってG4シグナルの増加が見られた。また、一部の細胞において、4OHT処理細胞においてG4安定化剤pyridostatin(PDS)とPhen-DC3に対する細胞毒性感受性が増加した。興味深いことに、PDSやPhen-DC3はPCNAユビキチン化とポリメラーゼetaのフォーカス形成を誘導した。これらの結果は、PDSが複製ストレスを誘導することを示唆する。そこで、ポリメラーゼetaの発現をsiRNAによって抑制したところ、PDSやPhen-DC3によるDNA損傷と細胞死を相乗的に促進した。以上より、Myc活性化による複製ストレスが部分的にDNA損傷の発生に関与しており、G4安定化剤とポリメラーゼeta阻害がMyc活性化細胞において合成致死作用を示すことが示唆された。

致癌基因的激活通过DNA损伤促进基因组不稳定性，同时也会导致细胞衰老和死亡。因此，阐明这种机制不仅对于理解癌症过程，而且对于开发治疗而言至关重要。据估计，基因组中有超过370,000个基序可以使单链DNA形成一个称为G4的二级结构。尽管鸟嘌呤四链体结构（G4）是DNA复制的障碍，但其在癌基因激活引起的DNA损伤中的作用尚不清楚。在这项研究中，我们创建了稳定表达ER-MYC融合基因在多个人类细胞系（U2OS，TERT-RPE1，HELA等）中的克隆，目的是阐明G4在癌基因诱导的DNA损伤中的作用。用4OHT处理这些细胞系会激活MYC，并观察到细胞周期停滞和诱导DNA损伤的细胞死亡。当用专门识别G4的单克隆抗体（BG4）染色核DNA的G4结构时，所有细胞在所有细胞中都通过4OHT处理增加了G4信号。此外，在某些细胞中，在4OHT处理的细胞中，增加了对G4稳定剂吡啶斯汀（PDS）和PEN-DC3的细胞毒性敏感性。有趣的是，PDS和PEN-DC3诱导PCNA泛素化和聚合酶ETA的聚焦形成。这些结果表明PD会诱导复制应力。因此，当聚合酶ETA的表达被siRNA抑制时，它协同促进了PDS和PEN-DC3的DNA损伤和细胞死亡。从以上提出，由MYC激活引起的复制应力部分与DNA损伤的发展有关，而G4稳定剂和聚合酶ETA抑制作用在MyC激活的细胞中呈现了合成的致死作用。