分裂酵母RNAポリメラーゼIIサブユニットを中心としたタンパク質相互作用の解析

以裂殖酵母RNA聚合酶II亚基为中心的蛋白质相互作用分析

• 批准号: 09780644
• 负责人: 木村 誠
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: National Institute of Genetics
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09780644/
• 关键词: RNAポリメラーゼII; 転写調節; 蛋白質相互作用; バキュロウイルス; 分裂酵母; 転写制御; 蛋白質間相互作用; 架橋剤; ファーウェスタン解析

RNAポリメラーゼII(Pol II)は、12種のサブユニット蛋白質で構成される。このうち、分裂酵母での遺伝子クローニングが遅れていたRpb4、Rpb9の2つのサブユニットの遺伝子をクローニングし、12種全ての遺伝子の単離を完了した。これらのcDNAを組み込んだバキュロウイルス発現ベクターを作製して、全てのサブユニットを昆虫細胞内で同時に発現させることに成功した。発現サブユニットに導入したタグに対するアフィニテイを用いた解析で、部分的なPol II様複合体の構成が認められた。また、Pol IIの本体構造についての解析を行い、以下の結果を得ている。精製Pol IIを架橋試薬で処理し、ウェスタン法でサブユニット間架橋体を同定する方法と、組換えサブユニット蛋白質を用いたファーウェスタン法による解析で、サブユニット間相互作用の全体像をほぼ決定した。小型サブユニットは、それぞれ、Rpb1、Rpb2の二つの大型サブユニットの一方または両方と相互作用をもち、小型サブユニット間の相互作用は、Rpb3-Rpb10、Rpb3-Rpb11、Rpb5-Rpb6、Rpb6-Rpb7、Rpb6-RPb8の間で検出された。また、試験官内で構成した伸長複合体のRNA3'末端に光反応性のUTP誘導体を導入し、伸長途中のRNAをPol IIに架橋して、活性中心を構成するサブユニットを特定した。活性中心はRpb1.Rpb2の二つのサブユニットにより構成される。さらに、架橋後これらのサブユニットを単離し、酵素で限定分解することにより、アミノ酸番号でRpb1の509-917、Rpb2の306-530、934-994の領域が活性中心の近傍に存在することを示した。

RNA was used to detect II (Pol II) and 12 kinds of protein in different concentrations. The spores of Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces cerevisiae were isolated, including Rpb4, Rpb9, Rpb9, R The whole cDNA system was used to detect the success of the insect cell in the same time. Now that you can use the Pol II to analyze the data, some of the parts of it will be integrated into a single unit. The following results are obtained from the following results: the data analysis line is created by using the ontology of Pol II. In this paper, we use the method of Pol II to determine the body of the frame, the method to analyze the protein, the method to determine the interaction, the method to determine the content of the protein, and the method to determine the interaction. Small-scale interaction, Rpb3-Rpb10, Rpb3-Rpb11, Rpb5-Rpb6, Rpb6-Rpb7, Rpb6-RPb8 and so on. The RNA3' end of the RNA3' is sensitive to light reaction.On the way to the growth, the Pol II is activated, and the active center is transformed into a specific enzyme. The active center, Rpb1.Rpb2, bivalently, isobaric, and the active center, the active center, has become an active center. There is a close proximity to the active center near the active center in the field of Rpb1 306-530,934-994, and so on.

项目成果

Hitomi Sakurai: "Identification of the gene and the protein of RNA polymerase II subunit 9(Rpb9)from the fission yeast Schizosaccharomycespombe" Gene. 221. 11-16 (1998)

Hitomi Sakurai：“裂殖酵母裂殖酵母 RNA 聚合酶 II 亚基 9 (Rpb9) 的基因和蛋白质的鉴定”基因。

Wjatschesslaw A.Wlassoff: "Functional organization of two large subunits of the fission yeast Schizo-saccharomycesspombe RNA polymerase II:location of the catalytic sites" Journal of Biological Chemistry. (in press). (1999)

Wjatschesslaw A.Wlassoff：“裂殖酵母 Schizo-saccharomycesspombe RNA 聚合酶 II 的两个大亚基的功能组织：催化位点的位置”《生物化学杂志》。

Akira Ishiguro: "Two large subunits of the fission yeast RNA polynerase II provide platforms for the assembly of small subunits" Journal of Molecular Biology. 279. 703-712 (1998)

Akira Ishiguro：“裂殖酵母 RNA 聚合酶 II 的两个大亚基为小亚基的组装提供了平台”《分子生物学杂志》。

Makoto Kimura: "RNA polymerase II subunit 2,3 and 11 from a core subassembly with DNA binding activity" Journal of Biological Chemistry. 272. 25851-25855 (1997)

Makoto Kimura：“来自具有 DNA 结合活性的核心子组件的 RNA 聚合酶 II 亚基 2,3 和 11”《生物化学杂志》。

Akira Ishihama: "Subunits of yeast RNA polymerase II:structure and function" Current Opinion in Microbiology. 1. 190-196 (1998)

Akira Ishihama：“酵母 RNA 聚合酶 II 亚基：结构和功能”微生物学当前观点。