RNAポリメラーゼIIを中心とした蛋白質相互作用による転写調節機構の解析

以RNA聚合酶II为中心的蛋白质相互作用转录调控机制分析

• 批准号: 11154225
• 负责人: 木村 誠
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: National Institute of Genetics
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11154225/
• 关键词: RNAポリメラーゼII; 分裂酵母; 蛋白質相互作用; バキュロウイルス

1.分裂酵母RNAポリメラーゼII(PolII)を構成するRpb1-Rpb12の12種のサブユニット蛋白質のうちRpb4を除く11種をコードするcDNAの1つまたは二つを組み込んだバキュロウイルスを作製し、これらを組み合わせた共感染により、サブユニット蛋白質を任意の組み合わせで、培養昆虫細胞内に発現されることに成功した。発現細胞内で構成されたサブユニット複合体の単離のため、Rpb3をグルタチオン-S-トランスフェラーゼとの融合蛋白質として発現し、Rpb1にはヒスチヂンタグ配列を付加した。11種のサブユニットを共発現した細胞抽出液からのグルタチオンアフィニティー、ニッケルイオンアフィニティーによる分離により、Rpb1,2,3,5,7,8,11の7サブユニットによる複合体が単離された。少数のサブユニットの共発現実験により、(1)Rpb1,2,5,7,8,11は、それぞれ、Rpb3と直接相互作用する。(2)Rpb11は、Rpb3との相互作用によりPolIIに集合する。(3)Rpb11によりRpb3-Rpb8の相互作用が強化される。(4)Rpb8により、Rpb1-Rpb3の相互作用が強化される。以上が明らかとなり、サブユニット集合過程での多重相互作用の重要性が示された。今後は、この系に改良を加えて、完全なPolIIの再構成を目指す。2.分裂酵母rpb4遺伝子を単離した。rpb4遺伝子、組換えRpb4蛋白質、抗Rpb4抗体等を用いた解析により以下の知見を得た。(1)分裂酵母Rpb4は、解析が先行している出芽酵母RPB4とは一次構造が大きく異なり、高等生物のRpb4と類似である。(2)出芽酵母RPB4は、一部のPolIIにしか含まれないが、分裂酵母Rpb4は、高等生物のものと同様、全てのPolIIに含まれる。(3)出芽酵母RPB4は必須遺伝子ではないが、分裂酵母Rpb4は必須遺伝子である。(4)分裂酵母、出芽酵母の異種間でRpb4-Rpb7のヘテロ二量体形成が可能である。以上より、分裂酵母PolIIは、高等生物PolIIのより優れたモデルであると言える。

1. Split yeast RNA fragment II(PolII) is composed of Rpb1-Rpb12 and 12 kinds of protein fragments. Rpb4 is composed of 11 kinds of cDNA fragments. The cDNA fragments are divided into two groups. The fusion protein of Rpb3 and Rpb1 was found in the cell. 11 kinds of cell extracts were found in the cell extracts, and 7 kinds of cell extracts were found in the cell extracts. A small number of Rpb1,2,5,7,8,11, 3, 4, 5, 6,7,8, 9, 10,11, 1 (2) The interaction between Rpb11 and Rpb3 is called PolII. (3) Rpb11-Rpb3-Rpb8 interaction is enhanced. (4) Rpb8 and Rpb1-Rpb3 interactions are intensified. The importance of multiple interactions in aggregation processes is demonstrated above. In the future, the improvement of the system will be added, and the reconstruction of the PolII will be completed. 2. Split yeast rpb4 gene Rpb4 gene, Rpb4 protein, anti-Rpb4 antibody, etc. were analyzed in the following ways. (1)Rpb4 is the first yeast to be analyzed. Rpb4 is the first yeast to be analyzed. (2)budding yeast RPB4, part of PolII, part of fission yeast RPB4, part of higher organisms, part of PolII, part of higher organisms (3)Budding yeast RPB4 must be transmitted, splitting yeast RPB4 must be transmitted. (4)Rpb4-Rpb7 is the most common type of yeast. The above is the best way to split yeast PolII and higher organisms PolII.

项目成果

Hitomi Sakurai: "The Rpb4 subunit of fission yeast SchizosaccharomycespombeRNA polymerase II is essential for cell viability and similar in structure to the correponding subunits of higher eukaryotes."Molecular and Cellular Biology. 19-11. 7511-7518

Hitomi Sakurai：“裂殖酵母 SchizosaccharomycespombeRNA 聚合酶 II 的 Rpb4 亚基对于细胞活力至关重要，其结构与高等真核生物的相应亚基相似。” 分子和细胞生物学。

Makoto Kimura: "Involvement of multiple subuni-subunit contacs in the assembly of RNA polymerase II."Nucleic Acids Research. 28-4. 952-959

Makoto Kimura：“RNA 聚合酶 II 组装中多个亚单位-亚单位接触的参与。”核酸研究。