分裂酵母RNAポリメラーゼIIの遺伝子組換え蛋白質による再構成

1.分裂酵母RNAポリメラーゼII(RNAPII)を構成するRpb1-Rpb12の12種類のサブユニット蛋白質をコードするcDNAの一つまたは二つを組込んだ組換えバキュロウイルスを約20種類作製した。これらのウイルスを培養昆虫細胞へ同時接種することにより、12種のサブユニット蛋白質を任意の組合せで同一細胞内に発現させることに成功した。その際、サブユニット集合の核となるRpb3は、グルタチオン-S-トランスフェラーゼとの融合蛋白質として、また、最大サブユニットRpb1にはヒスチヂンタグを付加して発現し、これらを利用したアフィニティークロマトグラフィーによりサブユニットの集合状態を解析した。12サブユニットの同時発現時には、Rpb1、2、3、5、7、8、11の7サブユニットによる複合体の構成が確認された。また、少数のサブユニットの同時発現においては、サブユニットの多重相互作用により集合が促進されることが見いだされた。2.RNAPII再構成方法確立のための基礎となる知見を得るため、サブユニット蛋白質の分裂酵母細胞内での集合状態について以下の解析を行った。(1)RNAPII各サブユニットに対する抗体を利用し、増殖期にある酵母細胞内の各サブユニット蛋白質の分子数を定量した。各サブユニット蛋白質は、RNAPI、IIIとの共通性を考慮しても発現量が揃っておらず、サブユニット集合の核になるRpb3が最も少なく、調節的な機能をもつRpb4が最も多い。(2)細胞抽出液の密度勾配遠心により、発現量の最も少ないRpb3は殆どRNAPIIに集合しているが、その他のサブユニットはRNAPIIへの集合状態と乖離状態の両方で存在していることが判った。これにより1細胞当たりのRNAPII分子数は約1万と決定された。(3)遺伝子置換により、Rpb1、3、4を緑色蛍光蛋白質との融合蛋白質として発現する分裂酵母株を作製し、蛍光顕微鏡でその局在を観察した。Rpb1、3は核内のヌクレオソーム領域に局在するが、Rpb4は核と細胞質の両方に存在することが明らかとなった。

1.分裂酵母RNAポリメラーゼII(RNAPII)を構成するRpb1-Rpb12の12種類のサブユニット蛋白質をコードするcDNAの一つまたは二つを組込んだ組換えバキュロウイルスを約20種類作製した。これらのウイルスを培養昆虫細胞へ同時接種することにより、12種のサブユニット蛋白質を任意の組合せで同一細胞内に発現させることに成功した。その際、サブユニット集合の核となるRpb3は、グルタチオン-S-トランスフェラーゼとの融合蛋白質として、また、最大サブユニットRpb1にはヒスチヂンタグを付加して発現し、これらを利用したアフィニティークロマトグラフィーによりサブユニットの集合状態を解析した。12サブユニットの同時発現時には、Rpb1、2、3、5、7、8、11の7サブユニットによる複合体の構成が確認された。また、少数のサブユニットの同時発現においては、サブユニットの多重相互作用により集合が促進されることが見いだされた。2.RNAPII再構成方法確立のための基礎となる知見を得るため、サブユニット蛋白質の分裂酵母細胞内での集合状態について以下の解析を行った。(1)RNAPII各サブユニットに対する抗体を利用し、増殖期にある酵母細胞内の各サブユニット蛋白質の分子数を定量した。各サブユニット蛋白質は、RNAPI、IIIとの共通性を考慮しても発現量が揃っておらず、サブユニット集合の核になるRpb3が最も少なく、調節的な機能をもつRpb4が最も多い。(2)細胞抽出液の密度勾配遠心により、発現量の最も少ないRpb3は殆どRNAPIIに集合しているが、その他のサブユニットはRNAPIIへの集合状態と乖離状態の両方で存在していることが判った。これにより1細胞当たりのRNAPII分子数は約1万と決定された。(3)遺伝子置換により、Rpb1、3、4を緑色蛍光蛋白質との融合蛋白質として発現する分裂酵母株を作製し、蛍光顕微鏡でその局在を観察した。Rpb1、3は核内のヌクレオソーム領域に局在するが、Rpb4は核と細胞質の両方に存在することが明らかとなった。