RNAポリメラーゼIIと相互作用をもつ蛋白質因子の単離とその機能の解析

与RNA聚合酶II相互作用的蛋白质因子的分离及其功能分析

• 批准号: 10173225
• 负责人: 木村 誠
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: National Institute of Genetics
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10173225/
• 关键词: RNAポリメラーゼII; 転写調節; 蛋白質相互作用; 分裂酵母

RNAポリメラーゼII(PolII)は、12種のサブユニット蛋白質で構成される。このうち、分裂酵母での遺伝子クローニングが遅れていたRpb4、Rpb9の2つのサブユニットの遺伝子をクローニングし、12種全ての遺伝子の単離を完了した。これらの遺伝子を用いて、サブユニット蛋白質にGST、ヘマグルチニン、ヒスチヂンクラスター等のタグを導入した分裂酵母株を作製した。これらの酵母株を大量培養し、タグに対するアフィニティーを利用した生化学的方法で、タグ導入サブユニットまたはそれを含むPolIIと複合体を形成する蛋白質の単離条件を検討中である。また、PolIIの本体構造についての解析を行い、以下の結果を得ている。精製PolIIを架橋試薬で処理し、ウェスタン法でサブユニット間架橋体を同定する方法と、組換えサブユニット蛋白質を用いたファーウェスタン法による解析で、サブユニット間相互作用の全体像をほぼ決定した。小型サブユニットは、それぞれ、Rpb1、Rpb2の二つの大型サブユニットの一方または両方と相互作用をもち、小型サブユニット間の相互作用は、Rpb3-Rpb10、RPb3-Rpb11、Rpb5-Rpb6、Rpb6-Rpb7、Rpb6-Rpb8の間で検出された。また、試験官内で構成した伸長複合体のRNA3'末端に光反応性のUTP誘導体を導入し、伸長途中のRNAをPolIIに架橋して、活性中心を構成するサブユニットを特定した。活性中心はRpb1、Rpb2の二つのサブユニットにより構成される。さらに、架橋後これらのサブユニットを単離し、酵素で限定分解することにより、アミノ酸番号でRpb1の509-917、Rpb2の306-530、934-994の領域が活性中心の近傍に存在することを示した。

RNAポリメラ ポリメラ ゼII(PolII) ゼ and 12 kinds of <s:1> サブユニット proteins で make up される. こ の う ち, split yeast で の posthumous son 伝 ク ロ ー ニ ン グ が 遅 れ て い た Rpb4, Rpb9 の 2 つ の サ ブ ユ ニ ッ ト の posthumous son 伝 を ク ロ ー ニ ン グ し, 12 full て の heritage 伝 son の 単 from finished を し た. こ れ ら の posthumous son 伝 を with い て, サ ブ ユ ニ ッ ト protein に GST, ヘ マ グ ル チ ニ ン, ヒ ス チ ヂ ン ク ラ ス タ ー etc. の タ グ を import し た split yeast strains を as the し た. こ れ ら の yeast strains を mass culture し, タ グ に す seaborne る ア フ ィ ニ テ ィ ー を using し た biochemistry method で, タ グ import サ ブ ユ ニ ッ ト ま た は そ れ を containing む PolII と complex を form す る protein の 単 from conditions を 検 beg in で あ る. Youdaoplaceholder0, the construction of the PolII block itself に る て て <s:1> analysis of を lines を, the result of the following block を gives て る る. Refined PolII を bridging try 薬 で 処 し, ウ ェ ス タ ン method で サ ブ ユ ニ ッ with fixed bridge between ト body を す と る method, group in え サ ブ ユ ニ ッ ト protein を い た フ ァ ー ウ ェ ス タ ン method に よ る analytical で, サ ブ ユ ニ ッ ト interaction between の all like を ほ ぼ decided し た. Small サ ブ ユ ニ ッ ト は, そ れ ぞ れ, Rpb1, Rpb2 の two つ の large サ ブ ユ ニ ッ ト の side ま た は struck party と interaction を も ち, small サ ブ ユ ニ ッ の interaction between ト は, Rpb3 - Rpb10, Rpb3 Rpb11, Rpb5 Rpb6, Rpb6 Rpb7, Rpb6 Rpb8 Between で検 comes された. ま た, test officer inner で し た elongation complex の RNA3 'に light at the end the 応 sex の UTP inductor を import し way, elongation の RNA を PolII に bridging し て, activity center を す る サ ブ ユ ニ ッ ト を specific し た. The active centers, <s:1> Rpb1 and Rpb2, <s:1> サブユニットによ and サブユニットによ, form される. After さ ら に, bridging こ れ ら の サ ブ ユ ニ ッ ト を 単 で limit from し, enzyme decomposition す る こ と に よ り, ア ミ ノ sour mash で Rpb1 の 509-917, Rpb2 の が の field 306-530, 934-994 active center の nearly exist alongside に す る こ と を shown し た.

项目成果

Hitomi Sakurai: "Identification of the gene and the protein of RNA polymerase II subunit 9(Rpb9)from the fission yeast Schizosaccharomycespombe" Gene. 221. 11-16 (1998)

Hitomi Sakurai：“裂殖酵母裂殖酵母 RNA 聚合酶 II 亚基 9 (Rpb9) 的基因和蛋白质的鉴定”基因。

Wjatschesslaw A.Wlassoff: "Functional organization of two large subunits of the fission yeast Schizo-saccharomycesspombe RNA polymerase II:location of the catalytic sites" Journal of Biological Chemistry. (in press). (1999)

Wjatschesslaw A.Wlassoff：“裂殖酵母 Schizo-saccharomycesspombe RNA 聚合酶 II 的两个大亚基的功能组织：催化位点的位置”《生物化学杂志》。

Akira Ishihama: "Subunits of yeast RNA polymerase II:structure and function" Current Opinion in Microbiology. 1. 190-196 (1998)

Akira Ishihama：“酵母 RNA 聚合酶 II 亚基：结构和功能”微生物学当前观点。

Akira Ishiguro: "Two large subunits of the fission yeast RNA polynerase II provide platforms for the assembly of small subunits" Journal of Molecular Biology. 279. 703-712 (1998)

Akira Ishiguro：“裂殖酵母 RNA 聚合酶 II 的两个大亚基为小亚基的组装提供了平台”《分子生物学杂志》。