多機能プロテアーゼインヒビター創製のための基礎研究

多功能蛋白酶抑制剂的基础研究

• 批准号: 08660059
• 负责人: 木村 誠
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08660059/
• 关键词: プロテアーゼインヒビター; タンパク質工学

デイゴ種子キモトリプシンインヒビターECIは、1分子で2分子のキモトリプシンを阻害することが推定されているが、その詳細な阻害機構は不明である。本申請研究では、ECIの第一の反応部位Leu^<64>を他の19種のアミノ酸に置換した変異体と、N末端10アミノ酸残基を削除した欠損体、さらにECIに存在する4つのループ構造の各2残基を欠損した4種の変異体を作製し、それらのキモトリプシン阻害活性を調べた。Leu^<64>の変異体とループ構造の変異体は、それぞれ変異を導入したプライマーを用いた部位特異的置換法により、またN末端10アミノ酸残基の削除は、PCR法により作製した。変異体遺伝子の大腸菌内での発現は、発現ベクターとしてpET-22b、宿主菌としてBL21(DE3)株を用いた。キモトリプシンに対する阻害活性は、カゼイン法を用いて測定した。その結果、64位をアルギニン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、およびメチオニンに置換した変異体は、野生型とほぼ同程度の阻害活性を保持していたが、その他のアミノ酸に置換した変異体の阻害活性は野生型の約1/5に低下していた。N末端10アミノ酸残基を削除した変異体は、ほとんど阻害活性を示さなかったが、4種のループ構造の変異体は完全な阻害活性を保持していた。本研究より、ECIにおいて、第一の反応ループの周辺構造がキモトリプシンとの相互作用に重要であることが示唆された。今後、第一の反応ループに位置する各アミノ酸の阻害活性への寄与をさらに詳細に調べていきたい。

1 molecule, 2 molecules, 3 molecules, 4 molecules, 5 molecules, 6 molecules, 7 molecules, 8 molecules, 9 molecules, 10 molecules, 10 molecules, 1 In this application, <64>19 kinds of amino acid substitutions, deletion of 10 amino acid residues at the N-terminal of ECI and 4 kinds of amino acid substitutions, deletion of 2 residues at the N-terminal of ECI were studied. Leu^<64>s variant structure is introduced by site-specific substitution method, N-terminal 10-amino acid residue deletion and PCR method The expression of the mutant in E. coli was detected by pET-22b and the host strain BL21 (DE3). The activity of the inhibitor was determined by the enzyme assay. As a result, the 64-position amino acid substitution, amino acid substitution, amino N-terminal 10-amino acid residues were removed, and the protective activity of all four kinds of structures was maintained. In this study, the interaction between ECI and the first anti-polarization structure is important. In the future, the position of the first anti-corrosion agent will be adjusted in detail.

项目成果

Yoshiaki Kouzuma et al.: "Purification, Characterization, and Sequencing of Two Cysteine Proteinase Inhibitors, Sca and Scb, from Sunflower(Helianthus annuus)Seeds" J.Biochem.119. 1106-1113 (1996)

Yoshiaki Kouzuma 等人：“来自向日葵种子的两种半胱氨酸蛋白酶抑制剂 Sca 和 Scb 的纯化、表征和测序”J.Biochem.119。

Tomohiro Nakagaki et al.: "Inhibitory Potency of Erythrina variegata Proteinase Inhibitors toward Serine Proteinases in the Blood Coagulation and Fibrinolytic Systems" Biosci, Biotech, Biochem.60・8. 1383-1385 (1996)

Tomohiro Nakagaki等：“刺桐蛋白酶抑制剂对血液凝固和纤维蛋白溶解系统中丝氨酸蛋白酶的抑制效力”Biosci，Biotech，Biochem.60・8（1996）。

Jun-ichi Kuramitsu: "Molecular Cloning of cDNA That Encodes Chymotrypsin Inhibitor ECI from Erythrina variegata Seeds and Its Expression in Escherichia coli" Biosci, Biotech, Biochem. 60・9. 1469-1473 (1996)

Jun-ichi Kuramitsu：“从刺桐种子中编码胰凝乳蛋白酶抑制剂 ECI 的 cDNA 的分子克隆及其在大肠杆菌中的表达”Biosci，Biotech，Biochem 1469-1473。