RNAポリメラーゼIIを中心とした蛋白質相互作用による転写調節機構の解析

以RNA聚合酶II为中心的蛋白质相互作用转录调控机制分析

• 批准号: 12028236
• 负责人: 木村 誠
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: National Institute of Genetics
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12028236/
• 关键词: 分裂酵母; RNAポリメラーゼ; 蛋白質相互作用; 転写因子; ホスファターゼ; マスフィンガープリント; 緑色蛍光蛋白質

1.RNAポリメラーゼII(RNAPII)を構成するRpb1-Rpb12の12種類のサブユニット蛋白質の分裂酵母細胞内での存在状態について以下の研究を行った。(1)RNAPII各サブユニットに対する抗体を利用し、増殖期にある酵母細胞内の各サブユニット蛋白質の分子数を定量した。各サブユニット蛋白質は、RNAPI、IIIとの共通性を考慮しても発現量が揃っておらず、サブユニット集合の核になるRpb3が最も少なく、調節的な機能をもつRpb4が最も多い。(2)細胞抽出液の密度勾配遠心により、発現量の最も少ないRpb3は殆どRNAPIIに集合しているが、その他のサブユニットはRNAPIIへの集合状態と乖離状態の両方で存在していることを示した。これにより1細胞当たりのRNAPII分子数は約1万と決定された。(3)遺伝子置換により、Rpb1、3、4を緑色蛍光蛋白質との融合蛋白質として発現する分裂酵母株を作製し、蛍光顕微鏡でその局在を観察した。Rpb1、3は核内のヌクレオソーム領域に局在するが、Rpb4は核と細胞質の両方に存在することが判った。2.RNAPIIと相互作用する蛋白質因子を単離・同定するため、遺伝子置換法によりFLAG-タグが付加されたRpb3を発現する酵母株を作製し、タグに対する抗体を利用して、RNAPIIを含む複合体を単離した。その際、細胞抽出液の調整方法を検討し、細胞内でRNA合成途中にあったリン酸化型RNAPII、DNAから遊離していた非リン酸化型RNAPII、それぞれを含む複合体を分離した。後者の複合体中の蛋白質は質量分析により、基本転写因子TFIIFとRpb1のC末端領域(CTD)特異的ホスファターゼFcp1であると同定された。これは新規の複合体である。また、分裂酵母のTFIIFが高等動物型ではなく、予想に反し、出芽酵母型の3サブユニット構成であるという新知見も得た。さらに、組換えFcp1蛋白質を用いた解析でRNAPIIとFcp1が直接結合することを確認した。

1. RNA ポ リ メ ラ ー ゼ II (RNAPII) を す る Rpb1 - Rpb12 の 12 kinds の サ ブ ユ ニ ッ ト protein の split yeast cells で の existence state に つ い を line っ て following の research た. (1) RNAPII various サ ブ ユ ニ ッ ト に す seaborne る antibody を using し, raised colonization period に あ る yeast cells の each サ ブ ユ ニ ッ ト protein molecular number を の quantitative し た. Each サ ブ ユ ニ ッ ト protein は, RNAPI, III と の convergence を consider し て も 発 now quantity が Jian っ て お ら ず, サ ブ ユ ニ ッ ト collection の nuclear に な る Rpb3 が most も less な く, regulating な function を も つ Rpb4 が most も い more. (2) the cell extract の density hook with telecentric に よ り, 発 now fewer の most も な い Rpb3 は perilous ど RNAPII に collection し て い る が, そ の he の サ ブ ユ ニ ッ ト は RNAPII へ の collection status と lovely from state の struck party で existence し て い る こ と を shown し た. When the number of た and <s:1> RNAPII molecules in a cell is approximately 10,000, と determines された. (3) posthumous son 伝 replacement に よ り, Rpb1, 3, 4 を 蛍 green light protein と の fusion protein と し て 発 now す る split し, the yeast strains を cropping 蛍 light 顕 micromirror で そ の bureau in を 観 examine し た. Rpb1, 3 は nuclear の ヌ ク レ オ ソ ー ム field に bureau in す る が, Rpb4 は nuclear と cytoplasm の struck party に existence す る こ と が convicted っ た. 2. RNAPII と interaction す る protein factor を 単 leaves, with fixed す る た め, but 伝 displacement method に よ り FLAG - タ グ が plus さ れ た Rpb3 を 発 now す る し, the yeast strains を cropping タ グ に す seaborne る antibody を using し て, RNAPII を composite containing む を 単 from し た. そ の interstate, cell extract の adjustment method を 検 please し, intracellular で RNA synthesis way に あ っ た リ ン acidification RNAPII, DNA か ら free し て い た non リ ン acidification RNAPII, そ れ ぞ れ を composite containing む を separation し た. の protein は quality analysis in the latter の complex に よ り, basic planning write factor TFIIF と Rpb1 の C terminal domain (CTD) specific ホ ス フ ァ タ ー ゼ Fcp1 で あ る と be さ れ た. Youdaoplaceholder0 れ the new regulation of the complex である. ま た, split yeast の TFIIF が type higher animals で は な く, to want to に し, budding yeast の 3 サ ブ ユ ニ ッ ト constitute で あ る と い う knowledge see も た. さ ら に, group in え Fcp1 protein を い た parsing で RNAPII と Fcp1 が directly combined す る こ と を confirm し た.

项目成果

Makoto Kimura: "Intracellular contents and assembly states of all 12 subunits of the RNA polymerase II in the fission yeast Schizosacchromyces pombe."European J.of Biochemistry. 268-3. 612-619 (2001)

Makoto Kimura：“裂殖酵母裂殖酵母中 RNA 聚合酶 II 的所有 12 个亚基的细胞内内容物和组装状态。”欧洲生物化学杂志。