マウス体外成熟卵を使用した体細胞クローン胚由来ES細胞の樹立

利用小鼠体外成熟卵建立体细胞克隆胚胎来源的ES细胞

• 批准号: 23930015
• 负责人: 下地 彩乃
• 金额: $ 0.38万
• 依托单位: University of Yamanashi
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
• 财政年份: 2011
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2011 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-23930015/
• 关键词: ES細胞; 体外成熟; 体細胞核移植

核移植胚由来ES細胞(nuclear transfer-derived embryonic stem cell ; ntES cell)は、体細胞核移植技術を用いて、除核未受精卵に体細胞の核を顕微注入して作出したクローン胚から樹立するが、クローン胚の作出、及びntES細胞の樹立には多数の新鮮未受精卵を必要とする。そこで、本研究では、婦人科手術により摘出される卵巣や卵巣切片から採取可能な未成熟卵に着目し、未成熟卵の体外成熟(in vitro maturation ; IVM)を実施して成熟卵を作出し、SCNTに利用できる可能性、また、それを用いて作出した胚からntES細胞が樹立できる可能性を、マウスを実験モデルとして検討した。実験方法は、未排卵誘発のB6D2F1雌マウスの卵巣から未成熟卵(germinal vesicle ; GV)を採取し、IVMを行って成熟卵を作出した。体外成熟培養にはTaM培地にAA-2G、E-64、Astaxanthinを添加したmodified TaM(mTaM)培地、HSAPプレコートディッシュを用いた。作出した成熟卵の核を除核後、卵丘細胞をドナー体細胞核として体細胞核移植を実施しクローン胚を作出した。IVMクローン胚の桑実胚/胚盤胞への発生率は、in vivo成熟コントロール胚の約5分の1と低率ではあったが、胚盤胞へと発生可能であった。次に、胚盤胞からntES細胞の樹立に試みた。結果、前核形成195クローン胚から5系列のIVM ntES細胞株(IVM ntES1-5)を樹立した。樹立した細胞株について、未分化マーカー遺伝子の発現を確認したところ、すべての細胞株で発現が確認できた。さらに、これらの細胞株の多能性を検討するためキメラマウスの作出を試みた。その結果、3系列(IVM ntES1,2,4)から11匹のキメラマウスが得られた。さらに、得られたキメラマウスをICRマウスと交配させたところ、1系列(IVM ntES1)でgermline transmissionを確認することができた。本研究により、体外成熟卵を再生医療のためのSCNTのソースとして利用可能であることが実験モデルにおいて確認され、将来的にはヒトの再生医療においても、体外成熟卵を、ntES細胞を樹立するためのソースとして利用できる可能性が拓かれた。

核转移的胚胎干细胞（NTES细胞）是通过使用体细胞细胞核转移技术将体细胞产生的克隆的胚胎建立的，但是许多新鲜的未受精卵都需要产生克隆的胚胎并建立NTES细胞。因此，在这项研究中，我们专注于未成熟的卵，这些卵可从妇科手术中已清除的卵巢和卵巢切片中收集，并检查了未成熟鸡蛋的体外成熟（IVM）的可能性，以生产和用于SCNT的生产和使用NTES细胞，并可能从创建胚胎中建立NTES细胞。实验方法涉及从未催化的雌性B6D2F1小鼠的卵巢中收集未成熟的卵（GV），并进行IVM产生成熟的卵。对于体外成熟培养，将含有AA-2G，E-64和astaxanthin的改良TAM（MTAM）培养基添加到TAM培养基中，并使用了HSAP Precoat Dish。在成熟卵的核中诱因后，将积云细胞用作供体细胞核和体细胞核的供体细胞核，以产生克隆的胚胎。 IVM克隆的胚胎到莫拉/胚泡中的发生率比体内成熟的对照胚胎的发生率低约五分之一，但可以发展成胚泡。接下来，我们尝试从胚泡建立NTES细胞。结果，从195个克隆胚胎建立了五个IVM NTES细胞系（IVM NTES1-5）。当确认未分化的标记基因的表达以确认已建立的细胞系时，在所有细胞系中都证实了表达。此外，我们试图生成嵌合小鼠以研究这些细胞系的多能性。结果，从三个系列（IVM NTES1,2,4）中获得了11只嵌合小鼠。此外，当用ICR小鼠繁殖嵌合小鼠时，可以在一个系列（IVM NTES1）中确认种系传递。这项研究在实验模型中证实，体外成熟的卵可以用作再生医学的SCNT来源，并打开了一种可能性，即将来，在人类再生医学中，体外成熟卵可将其用作NTES细胞的来源。

项目成果

マウス体外成熟卵を使用した体細胞クローン胚由来ES細胞の樹立

利用小鼠体外成熟卵建立体细胞克隆胚胎来源的ES细胞

• 发表时间: 2012
• 作者: Taira Y;Hayashida N;Yamashita S;Kudo T;Matsuda N;Takahashi J;Gutevitc A;Kazlovsky A;Takamura N;清水範彦;須藤美和子;石塚諭;石塚諭;清水由;広島大学附属東雲中学校;長岡樹;長岡樹;舩戸崇;関野智史;下地彩乃
• 通讯作者: 下地彩乃