マウス体外成熟卵を使用した体細胞クローン胚由来ES細胞の樹立

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核移植胚由来ES細胞(nuclear transfer-derived embryonic stem cell ; ntES cell)は、体細胞核移植技術を用いて、除核未受精卵に体細胞の核を顕微注入して作出したクローン胚から樹立するが、クローン胚の作出、及びntES細胞の樹立には多数の新鮮未受精卵を必要とする。そこで、本研究では、婦人科手術により摘出される卵巣や卵巣切片から採取可能な未成熟卵に着目し、未成熟卵の体外成熟(in vitro maturation ; IVM)を実施して成熟卵を作出し、SCNTに利用できる可能性、また、それを用いて作出した胚からntES細胞が樹立できる可能性を、マウスを実験モデルとして検討した。実験方法は、未排卵誘発のB6D2F1雌マウスの卵巣から未成熟卵(germinal vesicle ; GV)を採取し、IVMを行って成熟卵を作出した。体外成熟培養にはTaM培地にAA-2G、E-64、Astaxanthinを添加したmodified TaM(mTaM)培地、HSAPプレコートディッシュを用いた。作出した成熟卵の核を除核後、卵丘細胞をドナー体細胞核として体細胞核移植を実施しクローン胚を作出した。IVMクローン胚の桑実胚/胚盤胞への発生率は、in vivo成熟コントロール胚の約5分の1と低率ではあったが、胚盤胞へと発生可能であった。次に、胚盤胞からntES細胞の樹立に試みた。結果、前核形成195クローン胚から5系列のIVM ntES細胞株(IVM ntES1-5)を樹立した。樹立した細胞株について、未分化マーカー遺伝子の発現を確認したところ、すべての細胞株で発現が確認できた。さらに、これらの細胞株の多能性を検討するためキメラマウスの作出を試みた。その結果、3系列(IVM ntES1,2,4)から11匹のキメラマウスが得られた。さらに、得られたキメラマウスをICRマウスと交配させたところ、1系列(IVM ntES1)でgermline transmissionを確認することができた。本研究により、体外成熟卵を再生医療のためのSCNTのソースとして利用可能であることが実験モデルにおいて確認され、将来的にはヒトの再生医療においても、体外成熟卵を、ntES細胞を樹立するためのソースとして利用できる可能性が拓かれた。