蛍光タンパク質を用いたスプライシングレポーターの改良

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複数の蛍光タンパク質を用いて選択的スプライシングパターンを生体内で可視化するスプライシングレポーターミニ遺伝子では、蛍光タンパク質配列の上流に選択的スプライシングを受ける解析対象遺伝子のゲノムDNA断片を挿入してあり、特定のスプライシングパターンの時に蛍光タンパク質を発現する。このレポーターより発現した蛍光タンパク質は、挿入したゲノムDNA断片由来のタンパク質との融合タンパク質であるため、接続したこのタンパク質の性質に影響を受けて、蛍光や細胞内局在や安定性が損なわれることが多く、問題となっている。そこで、本研究では、次の2通りの方法で、上流の解析対象遺伝子断片由来のアミノ酸配列の影響を受けにくいスプライシングレポーターの開発を試みた。(1)ボリベプチドリンカーの挿入。蛍光タンパク質が安定して発現することを期待し、解析対象遺伝子断片と蛍光タンパク質の間に、特定の構造をとらないGly-Gly-Ser(GGS)の6回繰り返しアミノ酸配列のポリペプチドリンカーを挿入した。このレポーターを線虫に導入したところ、組織特異的な蛍光タンパク質の発現を確認することができ、スプライシイングパターンの組織特異性を示すことができた。これまでに、ポリペプチドリンカーを用いた蛍光スプライシングレポーター線虫を多数作製し、多くの場合、蛍光タンパク質が予想どおり発現していることを確認することができた。このことから、この蛍光スプライシングレポーターは実用上うまく機能していると考えられた。(2)自己切断配列の挿入。蛍光タンパク質が独立して発現することを期待し、解析対象遺伝子断片と蛍光タンパク質の間に、翻訳の際に自己切断することが知られているピコルナウィルスなどの2Aペプチドと呼ばれるアミノ酸配列を挿入した。このレポーターをまず培養細胞に導入し切断効率を解析したところ、文献で報告されているほどの効率ではなかった。2A自己切断配列の挿入については、切断効率を高める工夫をしたうえで実用性の試験をすることが今後の課題である。