新視点に立ったcPLA_2活性化機構の解析

新视角解析cPLA_2激活机制

• 批准号: 08772107
• 负责人: 中谷 良人
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Showa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08772107/
• 关键词: ホスホリパーゼA_2; 細胞質ホスホリパーゼA_2; エイコサノイド; 相互作用タンパク

まず、大腸菌を用いてグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)融合cPLA_2及びT7-tag融合cPLA_2の調製した。これらを材料にcPLA_2相互作用タンパクの検索を、Far-Western法により行った。その結果、マウス腹腔マクロファージ、マウス骨芽細胞株MC3T3-E1及びラット線維芽細胞株3Y1に、GST-cPLA_2とT7-cPLA_2の双方を用いた際に同様に検出される、分子量約60kDaのタンパク(p60)を見いだした。Far-Western解析を行う際に、バキュロウイルス発現系で調製したcPLA_2を過剰量添加すると、p60のバンドがほぼ完全に消滅したことから、p60はcPLA_2に特異的に結合すると結論した。また、p60は、cPLA_2のN末端138アミノ酸のみを融合した変異タンパクであるGST-cPLA_2(1-138)とも強く結合することがわかった。さらに、p60とcPLA_2の結合をEDTAが阻害した。cPLA_2のN末端領域には、Ca^<2+>濃度依存的な膜移行に必須なCaLBドメインと呼ばれる配列が存在している。従って、p60とcPLA_2の結合は、Ca^<2+>濃度依存的にCaLBドメインを介していることが予想された。p60の細胞内局在性を検討した結果、マクロファージではほぼすべてが膜画分に存在するのに対し、MC3T3-E1細胞では可溶性画分と膜画分の両方に同程度存在した。このことは、p60の機能の多様性を示していると考えられるが、さらなる検討が必要であると思われる。

まず、大腸菌を用いてグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)融合cPLA_2及びT7-tag融合cPLA_2の調製した。これらを material にcPLA_2 interaction タンパクの検SO を, Far-Western method により行った.そのRESULTS, MATSU peritoneal MASK, MATSU bone bud cell line MC3T3-E1 and びラットline fibroblast cell line 3Y1に, GST-cPL A_2とT7-cPLA_2 has a molecular weight of about 60kDa and a molecular weight of about 60kDa. Far-Western Analysisと、p60のバンドがほぼcomplete eliminationしたことから、p60はcPLA_2にspecific combinationするとconclusionした.また、p60は、cPLA_2のN-terminal 138アミノ acid のみをfusion した変isoタンパクであるGST-cPLA_2(1-138)とも强く合することがわかった.さらに, p60 and cPLA_2 are combined with EDTA and are blocked. The N-terminal domain of cPLA_2 is necessary for membrane migration depending on the concentration of Ca^<2+>, and the presence of CaLB is required.従って, p60 and cPLA_2 binding は, Ca^<2+> concentration-dependent にCaLB ドメインを Introduction していることが yu want to された. The results of intracellular localization of p60 and the existence of membrane delineation of the membrane Both the soluble and membrane components of MC3T3-E1 cells are present in the same degree. The functions of p60 are as follows:

项目成果

Murakami,M.,Nakatani,Y.,and Kudo,I.: "Type II secretory phospholipase A2 associated with cell surfaces via C-terminal heparin-binding lysine residues augments stimulus-initiated delayed prostaglandin generation" J.Biol.Chem.271. 30041-30051 (1996)

Murakami,M.、Nakatani,Y. 和 Kudo,I.：“II 型分泌型磷脂酶 A2 通过 C 末端肝素结合赖氨酸残基与细胞表面相关，增强刺激引发的延迟前列腺素生成”J.Biol.Chem.271