細胞質ホスホリパーゼA2(cPLA2)相互作用分子に関する研究

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グルタチオンSトランスフェラーゼ融合cPLA2をプローブとして利用したFar-Western解析によって検出された、ラット線維芽細胞株3Y1細胞に存在する分子量60kDaのcPLA2結合タンパク質(P60)は核マトリックスを豊富に含む画分(1%NP-40不溶性画分)に大部分が存在していたので、本画分を大量に調製し同定を試みた。ポリアクリルアミド電気泳動で分離後、P60のバンドを切り出し、リジルエンドペプチターゼを用いたクリーブランド法によるペプチドマッピングを行い、2つのペプチド断片のN末端アミノ酸配列を決定することができた。これらの配列をもとに3Y1のcDNAをtemplateに用いたdegenerated PCRによりP60のcDNA断片を得た後、遺伝子データベース検索した結果、細胞骨格系タンパク質であるビメンチン(分子量57kDa)と完全に一致した。先に決定したN末端アミノ酸配列は2つともビメンチンの配列中に見いだされ、双方ともにリジン残基の直後に位置していた。実際にcPLA2とビメンチンが結合するか否かを検討するため、大腸菌を用いてリコンビナントのビメンチンを作製しFar-Western解析を行った結果、結合が検出された。また、ビメンチンを自然発生的に欠損した株が存在する培養細胞SW13を材料に用いてFar-Western解析を行うと、天然型SW13細胞には分子量60kDaのバンドが検出されたが、ビメンチン欠損株では検出されなかった。以上の結果から、分子量60kDaのcPLA2結合タンパク質P60はビメンチンであると結論した。