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細胞質ホスホリパーゼA2(cPLA2)相互作用分子に関する研究

细胞质磷脂酶A2（cPLA2）相互作用分子的研究

基本信息

批准号：
09780581
负责人：
中谷良人
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Showa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

グルタチオンSトランスフェラーゼ融合cPLA2をプローブとして利用したFar-Western解析によって検出された、ラット線維芽細胞株3Y1細胞に存在する分子量60kDaのcPLA2結合タンパク質(P60)は核マトリックスを豊富に含む画分(1%NP-40不溶性画分)に大部分が存在していたので、本画分を大量に調製し同定を試みた。ポリアクリルアミド電気泳動で分離後、P60のバンドを切り出し、リジルエンドペプチターゼを用いたクリーブランド法によるペプチドマッピングを行い、2つのペプチド断片のN末端アミノ酸配列を決定することができた。これらの配列をもとに3Y1のcDNAをtemplateに用いたdegenerated PCRによりP60のcDNA断片を得た後、遺伝子データベース検索した結果、細胞骨格系タンパク質であるビメンチン(分子量57kDa)と完全に一致した。先に決定したN末端アミノ酸配列は2つともビメンチンの配列中に見いだされ、双方ともにリジン残基の直後に位置していた。実際にcPLA2とビメンチンが結合するか否かを検討するため、大腸菌を用いてリコンビナントのビメンチンを作製しFar-Western解析を行った結果、結合が検出された。また、ビメンチンを自然発生的に欠損した株が存在する培養細胞SW13を材料に用いてFar-Western解析を行うと、天然型SW13細胞には分子量60kDaのバンドが検出されたが、ビメンチン欠損株では検出されなかった。以上の結果から、分子量60kDaのcPLA2結合タンパク質P60はビメンチンであると結論した。

Far-Western analysis was used to detect and characterize the presence of cPLA2 binding protein (P60) with molecular weight of 60kDa in 3Y1 cells, and the presence of cPLA2 binding protein (1% NP-40 insoluble protein) in most of them. After electrophoresis separation, P60 is selected, and the N-terminal acid alignment of P60 is determined. The cDNA template of 3Y1 was degenerated by PCR, and the cDNA fragment of P60 was obtained. The results showed that the cytoskeleton system was completely consistent with that of 3Y1 (molecular weight 57kDa). First determine the N-terminal amino acid alignment and the position of the residue in the alignment. In the meantime, cPLA2 and the application of the test results and the test results of the Far-Western analysis were obtained. The naturally occurring defective strain exists in cultured SW13 cells. Far-Western analysis of the material is performed. The naturally occurring defective strain has a molecular weight of 60kDa. The above results show that cPLA2 with molecular weight of 60kDa binds to P60.