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有機塩素化合物を分解・資化する微生物のデハロゲナーゼ遺伝子のクローニング-組み換え菌による廃水処理の基礎として-

分解并同化有机氯化合物的微生物脱卤酶基因的克隆 - 作为使用重组细菌进行废水处理的基础 -

基本信息

批准号：
08780524
负责人：
越川博元
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

有機ハロゲン化合物により汚染された土壌・地下水の浄化を最終目的として、単離した有機ハロゲン化合物分解細菌が有する脱ハロゲン化酵素(デハロゲナーゼ)を精製し、その特性について検討をおこなった。また、本分解菌が持つデハロゲナーゼ遺伝子のクローニングを試みた。得られた主な結果は次の通りである。1.2,4-Dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D)を唯一の炭素源として生育した分解菌から粗酵素液を調製したところ、直鎖のハロ酸からの脱ハロゲン反応のみが確認された。また、活性染色によりそのデハロゲナーゼは1種類のみであることがわかった。2/このデハロゲナーゼの精製を試みたところ、分子量68,500(Da)、サブユニット34,000(Da)のホモダイマーであることがわかった。また、至適温度は45〜50℃、至適pH9〜10であり、その基質特異性はブロモ酢酸、ヨード酢酸、2-クロロプロピオン酸、2,3-ジクロロプロピオン酸などの比較的炭素数の少ないハロ酸に対して活性を示すことがわかった。3.本分解菌からその染色体DNAを抽出し、制限酵素Sau3AIで部分分解した。アガロースゲル電気泳動を行い、1〜10kbpの大きさをもつDNA断片をゲルから切り出したのち、これを精製した。あらかじめ用意しておいたプラスミドベクターpUC118にこのDNA断片を連結し、大腸菌JM109株に導入した。一般に大腸菌はブロモ酢酸存在下では生育できないが、デハロゲナーゼを有する大腸菌はブロモ酢酸存在下においても生育できるものと考えられたため、ブロモ酢酸に対して耐性を持つコロニーを検索した結果、目的とするコロニーが得られた。得られたコロニーからデハロゲナーゼ活性が検出されたため、現在プラスミドを抽出し挿入断片について検討している。

With the ultimate goal of degrading soil and groundwater contaminated by organic pectin compounds, the purification and purification of dehydropectin enzymes (dehulogannawei), which are found in bacteria that decompose organic pectin compounds, and their unique characteristics are thoroughly discussed. This is the first time I've ever seen one of these. The main result is that there is no communication between the two. 1.2,4-Dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D) is a unique carbon source and a precursor to the fermentation of crude enzymes.また、活性染色によりそのデハロゲナーゼは1种类のみであることがわかった。2/ The optimum temperature is 45 ~ 50℃, the optimum pH is 9 ~ 10, and the matrix specificity is low. The number of carbon acids, such as acetic acid, 2-acetic acid, and 2,3-acetic acid, is relatively low. 3. Chromosome DNA was extracted from the bacteria and partially decomposed by the restriction enzyme Sau3AI. The DNA fragments of 1 ~ 10kbp in length should be cut out and refined. The DNA fragment was linked to Escherichia coli strain JM109. In the presence of Escherichia coli, it is possible to reproduce. In the presence of Escherichia coli, it is possible to reproduce. Get a copy of the report. Get a copy of the report.