Na^+,K^+-ATPaseのイオン輸送機構の解明

「Na^+,K^+-ATPaseのイオン輸送機構において、イオンセンサーがイオン輸送ドメインに直接相互作用することによりイオン通過孔開閉を調節する」をいう分子内ドメイン作業仮説の証拠を得るために、次に上げるNa^+とK^+のセンサーを装備したNa^+,K^+ATPaseαサブユニットとSERCA-ATPase間のキメラATPaseを作製した。キメラATPaseの命名法としては、ニワトリを、リン酸化部位とFSBA結合部位を用いて3分割し、それぞれの領域を大文字のNまたはCで表記する。したがって野性型Na^+,K^+ATPaseαサブユニットはNNNと、野性型SERCA-ATPaseはCCCと表示する。また、これら3領域をさらに細分割した場合、それぞれの領域を小文字のnまたはcで表記する。また、ニワトリNa^+,K^+-ATPaseのウアバイン結合ドメインは、ウアバインに対して高親和性結合を示すため、作製したすべてのキメラATPaseのウアバイン結合ドメイン内には、2個のアミノ酸点変異(T115R,N126D)を施することによりウアバイン低親和性型に変換し、発現用のホスト細胞であるHeLa細胞に内在するヒト型Na^+,K^+-ATPaseウアバイン高親和性型と区別出来るように工夫した。[nn__-/n]C[n/n__=/n]キメラATPaseは、ウアバイン低親和性のNa^+,K^+-ATPase活性と^<86>Rb^+輸送能を有することが明らかとなったが、[nn__-/c]C[c/n__=/n]キメラATPaseは、Na^+,K^+-ATPase活性および^<86>Rb^+輸送活性のどちらの機能も認められなかった。本結果より、Na^+,K^+-ATPaseの機能発現には[nn__-/c]C[c/n__=/n]の小文字で示したc領域に相当するNa^+,K^+-ATPaseの領域が重要であることがわかった。また。種々のキメラATPaseを操作することにより、Na^+,K^+のイオン交換輸送におけるイオン交換比の決定には、Na^+,K^+-ATPaseのC末端領域が重要であることを、電気生理学と生化学的手法の併用により明らかにした。

「Na^+,K^+-ATPaseのイオン輸送機構において、イオンセンサーがイオン輸送ドメインに直接相互作用することによりイオン通過孔開閉を調節する」をいう分子内ドメイン作業仮説の証拠を得るために、次に上げるNa^+とK^+のセンサーを装備したNa^+,K^+ATPaseαサブユニットとSERCA-ATPase間のキメラATPaseを作製した。キメラATPaseの命名法としては、ニワトリを、リン酸化部位とFSBA結合部位を用いて3分割し、それぞれの領域を大文字のNまたはCで表記する。したがって野性型Na^+,K^+ATPaseαサブユニットはNNNと、野性型SERCA-ATPaseはCCCと表示する。また、これら3領域をさらに細分割した場合、それぞれの領域を小文字のnまたはcで表記する。また、ニワトリNa^+,K^+-ATPaseのウアバイン結合ドメインは、ウアバインに対して高親和性結合を示すため、作製したすべてのキメラATPaseのウアバイン結合ドメイン内には、2個のアミノ酸点変異(T115R,N126D)を施することによりウアバイン低親和性型に変換し、発現用のホスト細胞であるHeLa細胞に内在するヒト型Na^+,K^+-ATPaseウアバイン高親和性型と区別出来るように工夫した。[nn__-/n]C[n/n__=/n]キメラATPaseは、ウアバイン低親和性のNa^+,K^+-ATPase活性と^<86>Rb^+輸送能を有することが明らかとなったが、[nn__-/c]C[c/n__=/n]キメラATPaseは、Na^+,K^+-ATPase活性および^<86>Rb^+輸送活性のどちらの機能も認められなかった。本結果より、Na^+,K^+-ATPaseの機能発現には[nn__-/c]C[c/n__=/n]の小文字で示したc領域に相当するNa^+,K^+-ATPaseの領域が重要であることがわかった。また。種々のキメラATPaseを操作することにより、Na^+,K^+のイオン交換輸送におけるイオン交換比の決定には、Na^+,K^+-ATPaseのC末端領域が重要であることを、電気生理学と生化学的手法の併用により明らかにした。