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ヒトγδT細胞の認識する細菌性ピロリン酸系抗原の改変とその認識機構の解析

人γδT细胞识别细菌焦磷酸抗原的修饰及其识别机制分析

基本信息

批准号：
09770225
负责人：
田中義正
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Tokyo Women's Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

ヒトγδ型T細胞樹立株からmRNAを調製し、cDNAを合成後、PCRによりγ鎖およびδ鎖をクローニングした。さらにそれらの遺伝子をpEF-BOSベクターに組み込み、TCR欠損型Jurkat細胞に導入した。この際、マーカーとしてpST-NeoBを用い、ジェネテイシンに対する耐性を指標とした。960μF、250Vの条件においてエレクトロポレーションを行った結果、高い効率でγδ型TCRを表現するJurkat細胞を得ることができた。約50株のトランスフェクタント細胞を得たのち、CD3分子からのシグナル伝達を確認したところ、5株が強いシグナル伝達能を有することが明らかとなった。これらの細胞株を用い、ピロリン酸モノエステル系抗原認識におけるTCR依存性を確認した。現在にまでに明らかとなっている合成抗原であるモノエチルビロリン酸のほかに、今回新たに合成された高活性型抗原である、2-メチル-3-ブテニル-1-ピロリン酸を作用させ、IL-2の産生によりTCR依存性を確認した。以上の実験を独立に5回繰り返し検討した結果、いずれも同等の頻度で、細胞内シグナル伝達能を有する株が得られた。以上の結果より、ピロリン酸モノエステル系抗原の認識機構におけるTCR依存性が明らかとなった。またこれまでに点突然変異を導入した遺伝子のコンストラクトが得られているので、この系を用いることによりTCR鎖のいずれのアミノ酸残基が認識に関わっているか、検討することが可能になった。また、本年度までの研究において、TCRの細胞質および細胞膜領域を欠失させたコンストラクトを作成したので,Jurkat細胞に導入後、可溶性型のTCRを用いて、ビロリン酸モノエステル系抗原とTCRとの相互作用が解析可能になった。

γδ T cells are established by gene expression modulation, cDNA synthesis, PCR, and DNA sequencing. In addition, pEF-BOS was introduced into Jurkat cells with TCR deficiency. In this case, the pST-NeoB is used as an indicator of tolerance. The results of the electroporation test under the conditions of 960μF and 250V show that Jurkat cells can express γδ-type TCRs with high efficiency. About 50 strains of CD3 were identified and 5 strains of CD3 were identified. TCR dependence of these cell lines was confirmed in the context of antigen recognition. Now, we have identified the role of synthetic antigens in the production of IL-2 and the TCR dependence of IL-2 in the production of highly active antigens. The above results are obtained independently of each other, with the same frequency and with the same intracellular activity. The above results show that the recognition mechanism of antigen is TCR dependent. However, when a sudden change in the gene is introduced, a keyboard can be used, and this system can be used. This makes it possible to understand and discuss the amino acid residues contained in the TCR lock. This year's research shows that TCR cytoplasmic and cell membrane domains are not fully developed, and that soluble TCR can be used after introduction into Jurkat cells, and that TCR interaction can be resolved.