低酸素・虚血障害による胎児脳神経細胞死におけるカルシウム依存性プロテアーゼの動態

缺氧/缺血性损伤导致胎儿脑神经元细胞死亡过程中钙依赖性蛋白酶的动态

• 批准号: 09771292
• 负责人: 尾崎 康彦
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Nagoya City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09771292/
• 关键词: カルパイン; 脳神経細胞; 低酸素・虚血障害; 胎児仮死

低酸素状態による胎児新生児脳神経細胞障害におけるカルパインの動態を検討するために、神経培養細胞(GOTO:neuroblastoma cell line)とラット胎児脳神経初代培養細胞を用いて以下の実験を行い結果を得た。1、μ-及びm-カルパインの不活性前駆体型に対するベプチド抗体を作製した。2、神経細胞培養系の培養液の低酸素化(約20%)を酸素分圧測定器で確認した。3、低酸素培養による神経細胞内カルシウム濃度の増加(約0.7-1.0μM)を蛍光顕微鏡及び共焦点レーザー顕微鏡で確認した。4、低酸素培養下におけるカルパインの動態をカルパインインヒビターの存在、非存在下でのトリパンブルーテストによる生細胞率の測定、上記抗体を用いたWestem blotting法、免疫組織染色によって検討した。その結果、GOTO培養細胞及びラット胎児脳神経初代培養細胞において、低酸素処置によって生細胞数の減少が時間依存的に認められ、種々のカルパイン特異的インヒビターによって細胞死の抑制(回復)が認められた。免疫組織染色法では上記抗体によって核に特異的な染色が認められ、その染色性は低酸素処置によって低下した。Westem blotting法においても、同処理による上記抗体の染色性の低下が認められた。また、μ-カルパインのDomain-IIIに対する抗体によってμ-カルパインの活性化を示す染色性の低分子化が観察された。5、妊娠19日Wisterラットをエーテル麻酔下に開腹し、片側の子宮動脈を20分間遮断後、胎仔脳を摘出し実験4と同様にWestern Blotting法、免疫組織染色法に供した。対側胎仔を対照とした。その結果、Western blotting法で上記同様のμ-カルパインの活性化を示す結果が得られた。また胎盤においても同様の結果が得られた。以上より、神経細胞に存在するμ-カルパインが胎児新生児脳の低酸素状態による神経細胞障害において重要な役割を演じている事が示された。また、胎児胎盤系における低酸素状態においてもμ-カルパインが何らかの負の作用を演じている可能性が示唆された。

The following results were obtained from the study of the dynamics of hypoacidosis in neonatal neuroblastoma cells (GOTO:neuroblastoma cell line) and primary fetal neuroblastoma cells (GOTO:neuroblastoma cell line). 1, μ-and m-protypes of the inactive protypes are used to control the antibody production. 2. Hypoacidification (about 20%) of the culture medium of neurocell culture system was confirmed by acid pressure analyzer. 3. The increase of intracellular concentration of cytosol (about 0.7-1.0μM) in hypoactate culture was confirmed by light microscopy and confocal microscopy. 4. Determination of cell growth rate in the presence and absence of low acid hormone culture, Western blotting method and immunostaining method for the above mentioned antibodies. The results showed that the decrease of the number of cells in primary culture of GOTO cultured cells and fetal brain cells was time-dependent, and the inhibition of cell death (recovery) was identified by species-specific factors. Immunohistochemical staining is used to detect antibodies and nucleus-specific staining. Westem blotting method is used to detect the low staining activity of antibodies. Antibodies against Domain-III antibodies are observed in the presence of low molecular weight, low molecular weight, and high activity. 5. On the 19th day of pregnancy, the uterus artery was cut off at 20 minutes, and the fetus was extracted by Western Blotting and immunohistochemical staining. The fetus is on the right side. The results obtained by Western blotting were similar to those obtained by μ-blotting. The result is that the placenta is the same as the placenta. The above results show that there are many important factors in the development of neuronal damage due to the hypoacidity of newborn babies. The possibility of a negative effect on the fetal placental system is indicated.

项目成果

Mitoshi Kunimatsu: "Activation of Calpain in Myocardial Infarction : An Immunohistochemical Study using a Calpain Antibody Raised Against Active Site Histidine-Containing Peptide" Cardiovascular Pathology. 8・1. 7-15 (1999)

Mitoshi Kunimatsu：“心肌梗塞中钙蛋白酶的激活：使用针对活性位点组氨酸肽的钙蛋白酶抗体进行的免疫组织化学研究”心血管病理学8・1（1999）。