II型糖尿病モデル’OLETFラット’における肥満関連遺伝子の同定

II型糖尿病模型“OLETF大鼠”肥胖相关基因的鉴定

基本信息

批准号：
10770570
负责人：
山本裕之
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Shimane Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10770570/
关键词：
肥満関連遺伝子 OLETFラット視床下部 differetial display analysis

项目摘要

近年視床下部において摂食調節や肥満発症に関連したいくつかの遺伝子が同定されているが、未だ未知の摂食調節・肥満関連遺伝子の存在している可能性は大きい。II型糖尿病モデルであるOLETFラットの肥満の成因は未だ不明確である。そこで視床下部組織を用いたDifferential Display法により、肥満発症関連遺伝子の同定を試みた。【方法および結果】糖尿病は未発症ながら過体重を認める7週齢の雄性OLETFおよびLETOラット(N=各6)から視床下部組織を採取後、total RNAを抽出し、逆転写反応を行いcDNAを合成した。このcDNAを鋳型として[Y-^<32>P]dCTP標識3'アンカープライマー(GT12VG)と10merの任意5'プライマーを用いてPCRを行い、電気泳動後オートラジオグラフィーにて発現量を検討した。180種類のプライマーペアーを用いた結果、,OLETFラット視床下部で発現量が増加するmRNAバンドが4個、低下するものが14個再現性をもって認められた。これらのバンドを個々に切り出し、DNAを抽出後再増幅し、さらにサブクローニング後に塩基配列を決定した。結局、上記14個の候補cDNAのうちの1つ(任意5'プライマー:AGCGGCTAGG,mRNA fragment size:356bp)が、inner primer選択後に行った視床下部cDNAを鋳型としたRT-PCRにおいて、明らかにOLETFラットで発現量が低下していることが確認された。現在、5'RACE法等を用いて、この3'末端側cDNAフラグメントのクローニングとノザン法による視床下部組織でのmRNA発現量の差の確認ならびに各種組織での発現を調べる予定である。

近年来，在下丘脑中已经确定了与喂养调节和肥胖发展有关的几个基因，但是仍然存在未知的喂养调节和与肥胖相关的基因的可能性很高。 II型糖尿病模型OLETF大鼠肥胖的起源尚不清楚。因此，我们尝试使用下丘脑组织使用鉴别显示方法来鉴定与肥胖开始相关的基因。 [方法和结果]从7周龄的雄性OLETF和LETO大鼠（n = 6）收集下丘脑组织，这些组织无法解释但超重，并提取了总RNA，然后提取了总RNA，然后进行逆转录反应以合成CDNA。使用该cDNA作为模板，使用[Y - ^<32> p] DCTP标记的3'锚底漆（GT12VG）和10mer 5'引物进行PCR，并通过电泳和自显影检查表达水平。使用180个引物对，在OLETF大鼠的下丘脑中观察到4个具有升高表达水平和14个表达水平的mRNA带。分别切除这些频带，提取DNA并进行封闭，并在亚克隆后确定碱基序列。最后，人们证实，上述14个候选cDNA之一（任何5'底漆：Agcggctagg，mRNA片段大小：356 bp）在RT-PCR中使用下丘脑cDNA清楚地降低了RT-PCR中的OLETF大鼠，在内部引物选择后，将其作为模板作为模板。目前，我们计划使用5'race方法克隆该3'-末端cDNA片段，并使用北部方法确认下丘脑组织中mRNA表达水平的差异，并研究其在各种组织中的表达。