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スフィンゴシン塩基生合成の遺伝生化学的研究

鞘氨醇碱生物合成的遗传和生化研究

基本信息

批准号：
10771311
负责人：
花田賢太郎
金额：
$ 1.22万
依托单位：
National Institute of Infectious Diseases
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

项目摘要

スフィンゴ脂質生合成の初発ステップを担う酵素・セリン-パルミトイル転移酵素(SPT)は、少なくとも二種類のサブユニット(LCB1,LCB2)から構成される膜蛋白質である。SPTの精製が未だ成功しておらず、この酵素のサブユニット組成および触媒反応の詳細は解明されていない。そこで、この膜結合型複合酵素を極めて効率よく精製する方法を遺伝子工学的手法を取り入れて開発した。すなわち、先ず、FLAGペプチドおよびHis_6配列を付加したLCB1蛋白質を発現するベクターを構築し、内在性LCB1蛋白質が欠損したCHO細胞変異株(LY-B株)に遺伝子導入した。そして、得られた細胞株の膜画分から可溶化し、FLAG抗体クロマトグラフィーおよびNi-NTAクロマトグラフィーに供して、SPTを均一にまで精製した。精製SPTを解析した結果、本酵素はLCB1蛋白質とLCB2蛋白質が一対一の比で会合している複合酵素であることが明らかにした。さらに、生体中のスフィンゴシシの鎖長が主に18であることの原因は、SPTのアシルCoA選択性に起因することを示した。また、アミノ酸基質L一セリンのアミノ基、カルボキシル基、水酸基の全てが、SPTの基質認識に必須であることを明らかにした。しかし、興味深いことに、D一セリンは酵素基質とはならないが、SPT反応を競合的に阻害することを発見した。

The first step is the synthesis of lipids, the first step is the synthesis of enzymes, the first step is the production of enzymes (SPT), the second enzyme (LCB1,LCB2), and the other is the formation of membrane proteins. The SPT concentrate did not succeed and the enzyme enzyme was used to form the catalyst to explain the reaction. The combination of enzyme and membrane was used to detect the rate of enzyme replication. The method was used to analyze the techniques of engineering. The first, the first, the FLAG, the third, the first, the first, the first The membrane of the cell line was divided into three parts: soluble, FLAG antibody, Ni-NTA, SPT, and so on. The results of SPT analysis showed that this enzyme, LCB1 protein, LCB2 protein, rendezyme, biosynthetic enzyme, enzyme, protein, protein, In vivo, the host is responsible for 18% of the cause, and the SPT is responsible for the optional cause of CoA. It is important to know that the amino acid group, the SPT group, the acid group and the acid group. The combination of enzymes, enzymes, SPT, and so on, and so on, and so on.