Arylhydrocarbon receptor の細胞内機能の解析

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1.免疫染色によるAh receptor 細胞内局在の解析我々はAh receptor の細胞内局在を制御しているシグナル配列を決定するため、この配列を含む短いペプチド配列とGST-GFPとの融合タンパクを用いて解析をおこなってきた。本年度は細胞に発現させた全長AhRの局在様式を解析する為、Hisタグを融合したAhRの細胞内局在を、蛍光抗体による細胞染色で調べた。マウスHepa1c1c7細胞でHis-AhRを一過性に発現させた。コントロール細胞で主に細胞質に局在したのに対し、AhRリガンドであるメチルコランスレン(MC)処理すると核に局在した。一方、核外移行を阻害するレプトマイシンで処理によっても核局在が観察された。これらより、全長のAhRタンパク質についても核ー細胞質間を往復していることが示された。2.細胞内シグナル伝達系によるAhRの活性調節AhRの活性は細胞に内在するリガンドによって調節されていると考えられるが、ステロイドホルモン受容体や他の核内受容体で観察されているように、リン酸化などを介したシグナル伝達経路によっても制御されている可能性がある。そこで、細胞内シグナル伝達に重要な役割をもつRasタンパク質のAhR活性への影響を、AhR/ARNTが認識するXRE配列およびCYP1A1の5 '上流領域を連結したLuciferase発現プラスミドを用いて検討した。Hepa1c1c7細胞に活性化型Rasを遺伝子導入し、さらに細胞をMC処理すると、それぞれ単独処理と比べて高いLuciferase活性が検出された。このことはwestern blotにより検出されたCYP1A1タンパク質量によっても再現された。これらの結果から、AhR/ARNTによる転写調節機能はRasのシグナル系によって調節を受けることが示唆された。