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Ahレセプター機能の調節メカニズム

Ah受体功能的调控机制

基本信息

批准号：
15790083
负责人：
生田統悟
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Research Institute for Clinical Oncology, Saitama Cancer Center
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15790083/
关键词：
Ah receptor 表皮角化細胞 Slug ダイオキシン細胞密度 Ahレセプター ARNT keratinocyte 核移行核外移行

项目摘要

1 培養ケラチノサイトにおけるAhRの標的遺伝子の解析[目的と方法]Ah receptor (AhR)は、bHLH-PAS familyに属する受容体型転写因子である。リガンドとなるダイオキシンなど環境中の変異原物質と結合して活性化されると、細胞質から核へ移行してARNT蛋白質と複合体を形成し、DNA上のxenobiotics response element (XRE)に結合して転写を調節する。細胞内では外来リガンドに依存しないAhR本来の役割があると考えられるが、これについては不明な点が多い。我々は、表皮角化細胞株HaCaTを低カルシウム培地(SMEM)で培養すると、E-cadherinの発現様式の変化と並行してXRE依存的な転写が活性化されることを見い出した。本研究はAhR/ARNTの標的遺伝子を解析することにより、AhRの細胞内における機能を明らかにすることを目的とした。epithelial-mesenchymal-transitionに重要なSlug遺伝子がXREコンセンサス配列をもつことに着目し、その転写調節について検討した。[結果]ヒトgenomic DNAから、Slugの転写調節領域をPCRで増幅した。ルシフェラーゼアッセイの結果から、Slugの転写はAhRのDNA結合能に依存して活性化されることが示された。またAhR/ARNT複合体は、Slug開始コドンの上流約0.8kbに位置するXREに結合することがゲルシフトアッセイやChIPアッセイから示された。次にHaCaT細胞でSlugのmRNA量を、RT-PCRにより調べた。1μMメチルコラントレンまたはSMEMによる刺激後2時間で、Slug mRNA量は増加した。[結論]これらよりヒトSlugの転写は、AhR/ARNT/XRE複合体により活性化されることが示唆された。2 皮膚組織におけるAhRの分布様式マウスの背部皮膚を含む組織切片を作製し、市販の抗AhR抗体を用いて免疫染色をおこなった。胚齢15日目(E15)から重層化した表皮構造が認められた。E16の表皮ではbasal cellからsuprabasal cellにかけての染色性がみられたのに対し、E17-E19では有棘層-顆粒層にかけての細胞が染色された。この領域の染色性は出生後低下し、むしろbasal layerに近い部位に弱いながら染色が認められた。

1. Analysis of AhR receptor target gene in culture [Objective]Ah receptor (AhR) and bHLH-PAS family belong to the receptor-type factor. The binding and activation of various xenogens in the environment, the formation of cytoplasmic nuclear migration and ARNT protein complexes, and the binding and writing of xenobiotic response elements (XRE) on DNA are regulated. In the cell, there is no external dependence. In this paper, the epidermal keratinized cell line HaCaT was cultured in SMEM, and the expression of E-cadherin and XRE-dependent transcription were analyzed. The purpose of this study is to clarify the intracellular functions of AhR/ARNT target genes. Epithelial-mesenchymal-transition is an important part of the process. [Results] Genomic DNA amplification and Slug amplification were increased in the regulatory domain. As a result of this, Slug's DNA binding energy depends on the activation of AhR. The AhR/ARNT complex is located approximately 0.8 kb upstream of the Slug start point and is bound to the XRE. Next, HaCaT cells were regulated by mRNA levels and RT-PCR. 1μM Slug mRNA increased 2 days after stimulation. [Conclusion] The AhR/ARNT/XRE complex was activated by the enzyme. 2. The distribution of AhR in skin tissue was studied by immuno staining with anti-AhR antibody. E15: The structure of the epidermis is recognized as stratified. E16 has basal cells, suprabasal cells, and E17-E19 has granular cells. The color of this field is low after birth, and the basal layer is weak.