蛍光標識化DNAを用いた新規な測定法によるRecA蛋白質のDNA組換え反応の解析

使用荧光标记 DNA 的新测量方法分析 RecA 蛋白的 DNA 重组反应

• 批准号: 10780385
• 负责人: 増井 良治
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10780385/
• 关键词: RecA; 相同的組換え; 共鳴エネルギー転移; 蛍光DNA; RecA蛋白質; DNA結合; 蛍光標識; 高度好熱菌

遺伝情報の編成やDNA修復において重要である相同的組換え反応は,細菌ではRecA蛋白質が担っている。組換え反応の全容解明には,各々の素反応の詳細な解析,特に速度論的な解析が必要である。しかし,RecAの場合、反応過程を経時的に研究した報告はほとんどない。本研究では,複数の蛍光プローブを導入したDNAを用いて,蛍光の共鳴エネルギー転移を利用したDNA鎖の相互の配置の動的変化すなわち組換えの速度を推定し,組換え反応過程の経時的な変化を追跡することを試みた。まず,標識可能なアミノ基やチオール基を持つデオキシヌクレオチドを用いて二種類の蛍光標識化DNA(50-mer)を人工的に合成した。一方は分子中央にテトラメチルローダミン(R)を,もう1つは5'端にフルオレセイン(F),3'にテキサスレッド(T)を導入した。大腸菌RecA蛋白質は,すでに構築してある大量発現系を用いて調製した。次に,R-一本鎖DNAとRecAの相互過程を蛍光スペクトルを用いて測定したところ,少なくとも2つの結合相が観察された。このR-一本鎖DNA-RecA複合体にF/T-二本鎖DNAを加え,Rの励起光で励起したところ有意な蛍光スペクトル変化が見られた。反応前後の差スペクトルは,ほぼTのものに相当した。さらに,Tの蛍光波長で時間変化を測定したところ,大きく2つの相が見られた。このように,今回構築した測定系でRecA-一本鎖DNA複合体と二本鎖DNAとのペアリング反応を,蛍光エネルギー転移を利用して実際に測定できることが示された。

The genetic information is compiled and the DNA repair function is important. The same combination is used to replace the bacteria and the RecA protein of the bacteria is used. The comprehensive explanation of the combination of え濜のには, each 々の element の濜のdetailed analysis, and the analysis of the special velocity theory is necessary である.しかし, はほとんどない of ににたreport on RecA occasions and reaction process. This study is based on the introduction of the plurality of light into the DNA and the use of the resonance of the light and the use of the DNA lock. The change of the mutual configuration of the movement is the estimation of the speed of the group change, and the tracking of the change of the reaction process of the group change is the test of the test.まず, the logo may be なアミノbased やチオールbased をhold つデオキシヌクレオチドをDNA (50-mer) is artificially synthesized using light-labeled DNA of two kinds of いて. One party's molecular central にテトラメチルローダミン(R)を,もう1つは5' ENDにフルオレセイン(F),3'にテキサスレッド(T)を Importした. Escherichia coli RecA protein is used to build a large amount of Escherichia coli protein. Time に, R-a lock DNAとRecAのmutual processを蛍光スペクトルを用いてdeterminationしたところ, a little なくとも2つのcombination phase が看された.このR-One lock DNA-RecA complexにF/T-two locks DNAをplusえ,Rの利起光で利起したところ有purposeな蛍光スペクトル変化が见られた. The difference before and after the reaction is the same as the difference between the reaction and the reaction.さらに,Tの蛍 wavelength and time changeをmeasurementしたところ,大きく2つのphaseが见られた.このように, this time we constructed the したmeasurement system でRecA-Ipponlock DNA complex と二本码DNAとのペアリング Reflection 応を, 荍光エネルギー転动を Utilize して実记に to measure できることが Show された.

项目成果

Noriko Nakagawa: "Crystal structure of Thermus thermophilus HB8 UvrB protein, a key enzyme of nucleotide excision repair"The Journal of Biochemistry. 126(6). 986-990 (1999)

Noriko Nakakawa：“嗜热栖热菌 HB8 UvrB 蛋白的晶体结构，核苷酸切除修复的关键酶”《生物化学杂志》。

増井良治: "Probing of DNA-binding site of Escherichia coli RecA protein by utilizing 1-anilinonaphthalene-8-sulfonic acid" Biochemistry. 37・42. 14788-14797 (1998)

Ryoji Masui：“利用 1-苯胺萘-8-磺酸探测大肠杆菌 RecA 蛋白的 DNA 结合位点”生物化学 37・42（1998）。

Maria Spies: "The RadA protein from a hyperthermophilic archaeon Pyrobabulum islandicum is a DNA-dependent ATPase that shows two disparate catalytic modes, with a transition termperature at 75℃"European Journal of Biochemistry. 267(4)(in press). (2000)

Maria Spies：“来自超嗜热古细菌 Pyrobabulum islandicum 的 RadA 蛋白是一种 DNA 依赖性 ATP 酶，具有两种不同的催化模式，转变温度为 75℃”《欧洲生物化学杂志》267(4)（出版中）。 ）

増井良治: "好熱菌の全ゲノム配列決定とその意義"蛋白質核酸酵素. 44(2). 165-170 (1999)

Ryoji Masui：“嗜热细菌的全基因组测序及其意义”蛋白质核酸酶 44(2) (1999)。

Atsushi Yamagata: "Interaction of UvrA and UvrB proteins with a fluorescent single-stranded DNA"Journal of Biological Chemistry. 275(in press). (2000)

Atsushi Yamagata：“UvrA 和 UvrB 蛋白与荧光单链 DNA 的相互作用”生物化学杂志。