アミノアシルtRNA合成酵素のtRNA特異性の改変

(変異型aaRSの発現と精製)速度反論的解析によってtRNA特異性を明らかにするために,単離された変異型アルギニルtRNA合成酵素(ArgRS)の発現系を構築した.大腸菌内に存在する野生型酵素との分離がポイントであるので,目印となるアミノ酸配列をつけ加える.付加する部位としてC末端は不適であることが判明したので,N末端へ"ヒスチジン・タグ"を付加したが,このために,多くの変異型ArgRSは不溶性になってしまった.可溶化に成功した1種類の変異型ArgRSを精製し,次の解析を行った.(in vitroでの反応速度論的解析)精製した変異型ArgRSについて,野生型tRNA,およびセレクションに用いたアイデンティティー決定因子置換型tRNA(アンチコドンがICGからCUAに変化している)のそれぞれに対する反応定数を調べ,この結果を,野生型酵素の結果と比較した.変異型酵素は,決定因子を置換した人工的なtRNAに対する活性が,野生型酵素に比べて数倍改良されていることが明らかになった.変異型ArgRSに起きているアミノ酸置換を,報告されているArgRSの立体構造上にマップしたところ,これらのアミノ酸残基は決定因子との相互作用に直接関わる部位とは考えられない.今後の酵素改造に有益な知見を得るために,この基質特異性の変化の分子メカニズムの解明を行った.このことは,種々のtRNAにシステマティックに塩基置換を導入し,それぞれの活性を調べることで行った.その結果,決定因子の存在する位置を,一残基だけ"スリップ"して認識していることが明かになった.

(変異型aaRSの発現と精製)速度反論的解析によってtRNA特異性を明らかにするために,単離された変異型アルギニルtRNA合成酵素(ArgRS)の発現系を構築した.大腸菌内に存在する野生型酵素との分離がポイントであるので,目印となるアミノ酸配列をつけ加える.付加する部位としてC末端は不適であることが判明したので,N末端へ"ヒスチジン・タグ"を付加したが,このために,多くの変異型ArgRSは不溶性になってしまった.可溶化に成功した1種類の変異型ArgRSを精製し,次の解析を行った.(in vitroでの反応速度論的解析)精製した変異型ArgRSについて,野生型tRNA,およびセレクションに用いたアイデンティティー決定因子置換型tRNA(アンチコドンがICGからCUAに変化している)のそれぞれに対する反応定数を調べ,この結果を,野生型酵素の結果と比較した.変異型酵素は,決定因子を置換した人工的なtRNAに対する活性が,野生型酵素に比べて数倍改良されていることが明らかになった.変異型ArgRSに起きているアミノ酸置換を,報告されているArgRSの立体構造上にマップしたところ,これらのアミノ酸残基は決定因子との相互作用に直接関わる部位とは考えられない.今後の酵素改造に有益な知見を得るために,この基質特異性の変化の分子メカニズムの解明を行った.このことは,種々のtRNAにシステマティックに塩基置換を導入し,それぞれの活性を調べることで行った.その結果,決定因子の存在する位置を,一残基だけ"スリップ"して認識していることが明かになった.