Directed evolution of protein functional structures based on non-natural amino acid repertoire

基于非天然氨基酸库的蛋白质功能结构定向进化

• 批准号: 22H02591
• 负责人: 坂本 健作
• 金额: $ 8.99万
• 依托单位: Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2026-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H02591/
• 关键词: 拡張遺伝暗号; 非天然アミノ酸; 合成生物学; 大腸菌進化; タンパク質機能構造; 遺伝暗号; 進化実験; ヒドロキシ酸

非天然アミノ酸をUAGコドンに割り当てた大腸菌を用いて変異の蓄積実験を行った。遺伝子内にUAGコドンへの変異が生じた場合には、この変異位置に非天然アミノ酸がとりこまれたタンパク質が生じる。このような非正規変異がゲノム中に蓄積するかを検証した。古澤力博士（東大、理研）との共同研究の成果である。非天然アミノ酸としては AlocLysOH、3-ニトロチロシン、および3-ブロモチロシンを使用した。これらの非天然アミノ酸をそれぞれコード化した大腸菌B-95.ΔA株（よって3種類）を作成し、これらのアミノ酸が実際にタンパク質に取り込まれることを確認するとともに、これらのアミノ酸の導入効率を調べる実験を行った。これらの非天然アミノ酸の中でもAlocLysOHは、正確にはアミノ酸ではない非アミノ酸（ヒドロキシ酸）であることから本研究で最も興味深いターゲットであり、とくにタンパク質産物の質量分析や導入効率の詳細な解析を行った。また、非正規変異の蓄積が最も多かったものがAlocLysOHであったことから、以下の２つの結論は主にAlocLysOHについて得られた結果に基づくものである。（１）非天然アミノ酸を導入する分子システムは人為的なものであり大腸菌からは外部的な性格を持っているが、1400世代に及ぶ継代を経ても安定に大腸菌に保持された。（２）非アミノ酸であっても非正規変異の蓄積によって大腸菌プロテオームに入り込むことが許容されることが示された。通常のアミノ酸どうしの正規変異と比べても、AlocLysOHをタンパク質に導入する非正規変異の発生率が有意に小さいということはない。これらの結果は、人工的なアミノ酸であっても、非正規変異を通じて生物のプロテオームに蓄積できることを示している。このような非天然アミノ酸の性格は、選択圧が存在するときには生物進化を効率よく助長できると考えられる。

Unnatural ア ミ ノ acid を UAG コ ド ン に cut り when て た coliform を with い て - different の accumulation be 験 を line っ た. Heritage 伝 child within に UAG コ ド ン へ の - born different が じ た occasions に は, こ の - different location に unnatural ア ミ ノ acid が と り こ ま れ た タ ン パ ク qualitative が raw じ る. Youdaoplaceholder2 ような irregular variation がゲノム に accumulation する を検 を検 certificate た た. Dr. Gu Zeli (University of Tokyo, Riken) と と joint research と results である. Unnatural ア ミ ノ acid と し て は AlocLysOH, 3 - ニ ト ロ チ ロ シ ン, お よ び 3 - ブ ロ モ チ ロ シ ン を use し た. こ れ ら の unnatural ア ミ ノ acid を そ れ ぞ れ コ ー ド change し た coliform B - 95. Δ A strain (よ っ て 3 kinds) を し, consummate こ れ ら の ア ミ ノ acid が be interstate に タ ン パ ク qualitative に take り 込 ま れ る こ と を confirm す る と と も に, こ れ ら の ア ミ ノ acid の import working rate を adjustable べ る be 験 を line っ た. こ れ ら の unnatural ア ミ ノ acid in の で も AlocLysOH は, correct に は ア ミ ノ acid で は な い non ア ミ ノ acid (ヒ ド ロ キ シ acid) で あ る こ と か ら で も most fun this study deep い タ ー ゲ ッ ト で あ り, と く に タ ン パ ク の quality products quality analysis や import line working rate の detailed analytical を な っ た. ま た, informal - different の accumulation が more than most も か っ た も の が AlocLysOH で あ っ た こ と か ら, the following 2 つ の の conclusion は main に AlocLysOH に つ い て have ら れ た results に づ く も の で あ る. (1) the natural ア ミ ノ acid を import す る molecular シ ス テ ム は man-made な も の で あ り coliform か ら は external な character を hold っ て い る が, 1400 generation に and ぶ 継 generation を 経 て も settle に coliform に keep さ れ た. (2) the ア ミ ノ acid で あ っ て も informal - different の accumulation に よ っ て coliform プ ロ テ オ ー ム に into り 込 む こ と が allowable さ れ る こ と が shown さ れ た. Usually の ア ミ ノ acid ど う し の than normal - different と べ て も, AlocLysOH を タ ン パ ク qualitative に import す る informal - different の 発 birth rate が intentionally に small さ い と い う こ と は な い. こ れ ら の results は, artificial な ア ミ ノ acid で あ っ て も, informal - different を じ て biological の プ ロ テ オ ー ム に accumulation で き る こ と を shown し て い る. こ の よ う な unnatural ア ミ ノ acid は の character, sentaku 圧 が exist す る と き に は evolution を sharper rate よ く fuelling で き る と exam え ら れ る.

项目成果

非アミノ酸を含む遺伝暗号の開発と大腸菌進化への影響

含有非氨基酸的遗传密码的开发及其对大肠杆菌进化的影响

• 发表时间: 2022
• 作者: 大竹 和正;芝井 厚;古澤 力;坂本 健作
• 通讯作者: 坂本 健作

非アミノ酸を含む遺伝暗号の下での大腸菌進化

大肠杆菌在含有非氨基酸的遗传密码下进化

• 发表时间: 2022
• 作者: 大竹 和正;芝井 厚;古澤 力;坂本 健作
• 通讯作者: 坂本 健作

拡張遺伝暗号に基づく抗体デザイン

基于扩展遗传密码的抗体设计

• 发表时间: 2022
• 作者: 坂本 健作;林 明子;山口 純;Aditya K. Padhi;Ashutosh Kumar;Kam Y. J. Zhang
• 通讯作者: Kam Y. J. Zhang