Directed evolution of protein functional structures based on non-natural amino acid repertoire

基于非天然氨基酸库的蛋白质功能结构定向进化

• 批准号: 22H02591
• 负责人: 坂本 健作
• 金额: $ 8.99万
• 依托单位: Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2026-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H02591/
• 关键词: 拡張遺伝暗号; 非天然アミノ酸; 合成生物学; 大腸菌進化; タンパク質機能構造; 遺伝暗号; 進化実験; ヒドロキシ酸

非天然アミノ酸をUAGコドンに割り当てた大腸菌を用いて変異の蓄積実験を行った。遺伝子内にUAGコドンへの変異が生じた場合には、この変異位置に非天然アミノ酸がとりこまれたタンパク質が生じる。このような非正規変異がゲノム中に蓄積するかを検証した。古澤力博士（東大、理研）との共同研究の成果である。非天然アミノ酸としては AlocLysOH、3-ニトロチロシン、および3-ブロモチロシンを使用した。これらの非天然アミノ酸をそれぞれコード化した大腸菌B-95.ΔA株（よって3種類）を作成し、これらのアミノ酸が実際にタンパク質に取り込まれることを確認するとともに、これらのアミノ酸の導入効率を調べる実験を行った。これらの非天然アミノ酸の中でもAlocLysOHは、正確にはアミノ酸ではない非アミノ酸（ヒドロキシ酸）であることから本研究で最も興味深いターゲットであり、とくにタンパク質産物の質量分析や導入効率の詳細な解析を行った。また、非正規変異の蓄積が最も多かったものがAlocLysOHであったことから、以下の２つの結論は主にAlocLysOHについて得られた結果に基づくものである。（１）非天然アミノ酸を導入する分子システムは人為的なものであり大腸菌からは外部的な性格を持っているが、1400世代に及ぶ継代を経ても安定に大腸菌に保持された。（２）非アミノ酸であっても非正規変異の蓄積によって大腸菌プロテオームに入り込むことが許容されることが示された。通常のアミノ酸どうしの正規変異と比べても、AlocLysOHをタンパク質に導入する非正規変異の発生率が有意に小さいということはない。これらの結果は、人工的なアミノ酸であっても、非正規変異を通じて生物のプロテオームに蓄積できることを示している。このような非天然アミノ酸の性格は、選択圧が存在するときには生物進化を効率よく助長できると考えられる。

使用大肠杆菌进行突变积累实验，该大肠杆菌的非天然氨基酸分配给UAG密码子。如果对UAG密码子发生突变发生在基因内，则会发生在此突变位置上掺入非天然氨基酸的蛋白质。我们研究了这种非正常突变是否在基因组中积累。这是与Furusawa Riki博士（Tokyo University，Riken）进行联合研究项目的结果。非天然氨基酸包括绿色素，3-硝基酪氨酸和3-溴酪氨酸。我们创建了大肠杆菌B-95.ΔA菌株（因此三种类型），编码了这些不自然的氨基酸，并进行了一项实验，以确认这些氨基酸实际上已掺入蛋白质中，并研究了这些氨基酸引入的效率。在这些不自然的氨基酸中，Aloclysoh是这项研究中最有趣的靶标，因为它不是完全不是氨基酸的氨基酸（羟基酸），尤其是我们对蛋白质产物和引入效率进行了详细分析。此外，由于Aloclysoh是最累积的非正常突变，因此以下两个结论主要基于alocloclysoh获得的结果。 （1）引入非天然氨基酸的分子系统是人造的，具有大肠杆菌的外部特征，但即使在通过1400代后，也可以稳定保留在大肠杆菌中。 （2）已经表明，即使是非氨基酸也可以通过非正常突变的积累进入大肠杆菌蛋白质组。与氨基酸之间的正常突变相比，将aloclysoh引入蛋白质的非正常突变的发生率并不明显小。这些结果表明，即使是人造氨基酸也可以通过非经典突变积聚在生物体的蛋白质组中。人们认为，当存在选择性压力时，这种不自然的氨基酸的性质可以有效地促进生物进化。

项目成果

非アミノ酸を含む遺伝暗号の開発と大腸菌進化への影響

含有非氨基酸的遗传密码的开发及其对大肠杆菌进化的影响

• 发表时间: 2022
• 作者: 大竹 和正;芝井 厚;古澤 力;坂本 健作
• 通讯作者: 坂本 健作

拡張遺伝暗号に基づく抗体デザイン

基于扩展遗传密码的抗体设计

• 发表时间: 2022
• 作者: 坂本 健作;林 明子;山口 純;Aditya K. Padhi;Ashutosh Kumar;Kam Y. J. Zhang
• 通讯作者: Kam Y. J. Zhang

非アミノ酸を含む遺伝暗号の下での大腸菌進化

大肠杆菌在含有非氨基酸的遗传密码下进化

• 发表时间: 2022
• 作者: 大竹 和正;芝井 厚;古澤 力;坂本 健作
• 通讯作者: 坂本 健作