好中球NADPHオキシダーゼの活性化におけるp40^<phox>の役割

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生体防御において重要な役割を担う好中球NADPHオキシダーゼは、病原微生物等の貪食など、細胞が刺激された時に、細胞休止期には細胞内に存在する蛋白質(p40^<phox>,p47^<phox>,p67^<phox>,Racが、細胞膜に移行して膜蛋白質であるシトクロムb_<558>と結合することにより活性化される。この活性型NADPHオキシダーゼはスーパーオキシド(O_2^-)を産生し、このO_2^-から派生した様々な活性酸素種は強力な殺菌作用を持つ。p40^<phox>は、p67^<phox>およびp47^<phox>両者と結合する蛋白質であり、NADPHオキシダーゼの構成蛋白質の中で重要な役割を持つと考えられるにもかかわらず、その役割は今まで解っていなかった。そこで、申請者らは以下の解析を行なった。p40^<phox>遺伝子をネオマイシン耐性遺伝子とともにプラスミドによりp40^<phox>欠損K562細胞に導入した。p40^<phox>や他のNADPHオキシダーゼ構成蛋白質の発現はウエスタンブロット法とフローサイトメトリー法により確認した。これら細胞質蛋白質を発現させたK562の蛋白質間相互作用は免疫沈降法により、好中球と同様に結合していることを確かめた。p40^<phox>を発現しているK562のNADPHオキシダーゼ活性化後のO_2^-の生成量は、発現していないK562にくらべ約3倍に上昇していた。この原因を解析する目的で、細胞膜への細胞質オキシダーゼ蛋白質の移行量を、抗体を用いた細胞染色法と細胞分画法による膜画分のウエスタンブロット法により解析した。p47^<phox>と結合ができなくなる変異をSH3ドメインに持つp40^<phox>、あるいはp67^<phox>と結合できない変異をPCモチーフに持つp40^<phox>を、p40^<phox>欠損K562に遺伝子導入した。この変異蛋白質はp47^<phox>やp67^<phox>と結合ができないことを免疫沈降法により確かめた。