GPIアンカー型GFPトランスジェニックマウスによるGPIアンカー生合成系の解析

使用 GPI 锚定 GFP 转基因小鼠分析 GPI 锚定生物合成系统

• 批准号: 11770118
• 负责人: 近藤 玄
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11770118/
• 关键词: GPIアンカー; EGFP; トランスジェニックマウス; 蛋白精製; 顎下腺; 腺性カリクレイン; 精巣; 遊離; 上皮組織; 頂端部局在化; 外分泌膜; 分泌

グリコシルフォスファチジルイノシトール(GPI)は、アルカリフォスファターゼやThy-1等を代表とするGPIアンカー型蛋白質を細胞膜上につなぎ止めるのに必須の糖脂質である。一方、いくつかのGPIアンカー型蛋白質は、細胞膜上にとどまるばかりでなく、細胞外に放出されることは知られているが、その遊離メカニズムや生理的意義はよくわかっていない。我々は、生体内におけるGPIの動態を解明するため、GPIアンカー型に改変した蛍光蛋白質EGFP(EGFP-GPI)をレポーターとして作成し、これを導入したトランスジェニックマウス家系を樹立した。このマウスでは、上皮系組織においてEGFP-GPIの頂端部局在化がみられ、また、膵臓・顎下腺・精嚢等の外分泌腺および精巣において、EGFP-GPIの体液中への遊離が認められた。そこで、本年度は、GPIアンカー型蛋白質遊離に関わる因子の同定を試み、以下の結果を得た。1)顎下腺組織より、抽出液を調整し、EGFP-GPI発現細胞からのEGFP-GPIの培養液中への遊離を指標に、GPIアンカー型蛋白質遊離因子の精製を、陰イオン交換、疎水性相互作用、ゲルろ過液体クロマトグラフィーにて行った。その結果、新規の腺性カリクレイン様蛋白が、同定された。しかしながら、この蛋白は、EGFP-GPIのみならず、膜貫通型EGFP(EGFP-TM)に対しても遊離活性を示す、また、GPIアンカー型蛋白の一種である胎盤型アルカリフォスファターゼ(PLAP)を遊離しないことから、真のGPIアンカー型蛋白質遊離因子としては、否定的であると考えられた。2)精巣組織より、抽出液を調整し、EGFP-GPIおよびPLAPのTritonX-100可溶相から水溶相への転換を指標にGPIアンカー型蛋白質遊離因子の精製を、陰イオン交換、ConAアフィニティー、ゲルろ過液体クロマトグラフィーにて行った。まだ、部分精製の段階であるが、いくつかの性質が判明した。(1)おそらく、膜結合型蛋白である。(2)Ca依存性の酵素活性がある。(3)塩基性蛋白である。(4)予想分子量が60-70kdである。(5)精子形成の開始とともに酵素活性が上昇する。(6)代謝産物が、PLC切断残基を認識する抗CRD(cross-reactive determinant)抗体に反応しない。(7)EGFP-TMに対しては、遊離活性を示さない。現在、この精巣におけるGPIアンカー型蛋白質遊離因子の精製をさらに進めている。

グ リ コ シ ル フ ォ ス フ ァ チ ジ ル イ ノ シ ト ー ル (GPI) は, ア ル カ リ フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ や Thy - 1 を representative と す る GPI ア ン カ ー を type protein membrane に つ な ぎ check め る の に must の sugar lipid で あ る. Party, い く つ か の GPI ア ン カ ー は protein, cell membranes に と ど ま る ば か り で な く, extracellular に release さ れ る こ と は know ら れ て い る が, そ の free メ カ ニ ズ ム や physiological significance は よ く わ か っ て い な い. I 々 は, born in vivo に お け る GPI の dynamic を interpret す る た め, GPI ア ン カ ー type に change - し た 蛍 light EGFP protein (EGFP - GPI) を レ ポ ー タ ー と し て し, consummate こ れ を import し た ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス family を set し た. こ の マ ウ ス で は, epithelial tissue に お い て EGFP - GPI の top bureaus in turn が み ら れ, ま た, Cui viscera under jaw gland, fine 嚢 の exocrine gland お よ び fine 巣 に お い て GPI の body fluids, the EGFP - へ の free が recognize め ら れ た. そ こ で, this year's は, GPI ア ン カ ー type protein free に masato わ る factor の with fixed を み, the result of the following の を た. 1) under the jaw gland tissue よ り, extract を adjustment し, GPI 発 EGFP - now cell か ら の EGFP - GPI の medium, へ の free に を index, GPI ア ン カ ー protein free factor の refined を, Yin イ オ ン exchange, water-based 疎 interaction, ゲ ル ろ through liquid ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に て line っ た. Youdaoplaceholder0 そ result, new regulation of <s:1> glandular カリ レ レ <s:1> protein が, same standard された. し か し な が ら, こ の は, EGFP protein - GPI の み な ら ず, transmembrane EGFP (EGFP) - TM に し seaborne て も free active を す, ま た, GPI ア ン カ ー type protein の a で あ る placenta type ア ル カ リ フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ (PLAP) を free し な い こ と か ら, true の GPI ア ン カ ー protein The mass ionization factor と て て て, negative であると examination えられた. 2) fine 巣 organization よ り, extract を adjust し and EGFP - GPI お よ び PLAP の TritonX - 100 soluble phase か ら water soluble phase へ の planning in を index に GPI ア ン カ ー protein free factor の refined を, Yin イ オ ン exchange, ConA ア フ ィ ニ テ ィ ー, ゲ ル ろ through liquid ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に て line っ た. Youdaoplaceholder0, partially refined <s:1> grade であるが, く く が が が properties が determination of た. (1)おそらく, membrane-bound protein である. (2) ca-dependent enzyme activity がある. (3) Basic protein である. (4) The imagined molecular weight is が60-70kdである. (5) Sperm formation begins with とと に に enzyme activity が increases する. (6) Metabolites が, PLC cut-off residues を recognition する anti-CRd (cross-reactive determinant) antibody に anti-応 な な 応. (7)EGFP-TMに against て て and free activity を showed さな さな. Now, the <s:1> <s:1> refined におけるGPIア ア カ カ カ <s:1> type protein free factor をさらに is refined をさらに into めて めて る る る.

项目成果

kondoh G.: "Easy assessment of ES cell clone potency for chimeric development and germ-line competency by an optimized aggregatipn method"J. Biochem. Miophy. Methods.. 39-3. 137-142 (1999)

kondoh G.：“通过优化的聚合方法轻松评估 ES 细胞克隆嵌合体发育和种系能力的能力”J.

kondoh G.: "Tissue-inherent fate of GPI revealed by GPI-anchored GFP transtenesis"FRBS Lett.. 458-3. 299-303 (1999)

kondoh G.：“GPI 锚定的 GFP 转带揭示了 GPI 的组织固有命运”FRBS Lett.. 458-3。

Takeda,J.: "Conditional gene targeting and its application in the skin."J.Dermatol.Sci.. 23. 147-154 (2000)

Takeda, J.：“条件基因靶向及其在皮肤中的应用。”J.Dermatol.Sci.. 23. 147-154 (2000)

Kawamoto,S.: "A novel reporter mouse strain that expresses enhanced green fluorescent protein upon Cre-mediated recombination."FEBS Lett.. 470. 263-268 (2000)

Kawamoto,S.：“一种新的报告小鼠品系，通过 Cre 介导的重组表达增强的绿色荧光蛋白。”FEBS Lett.. 470. 263-268 (2000)

Yamamoto Y.: "Myelin-associated oligodendrocytic basic protein is essential for normal arrangement of the radial component in the central nervous system myelin"Euro. J. Neurosci.. 11. 847-855 (1999)

Yamamoto Y.：“髓磷脂相关少突胶质细胞碱性蛋白对于中枢神经系统髓磷脂径向成分的正常排列至关重要”Euro。