高度好熱菌における動物細胞MDR類似輸送担体の機能解析

高度嗜热细菌中动物细胞MDR样转运载体的功能分析

• 批准号: 11771406
• 负责人: 宮内 正二
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11771406/
• 关键词: 高度好熱菌; ABC輸送担体; 多剤排出輸送担体; 大量発現; MDR; 膜蛋白

基質の検討を行う目的で、大腸菌のpET systemにより、TmlpAおよびTmlpBの大腸菌における大量発現系の構築を試みた。これら蛋白は膜蛋白の10%発現していた。大腸菌膜蛋白のSDS電気泳動をPVDF膜にブロッティングし、N末アミノ酸シークエンスを行い、目的とする蛋白であることを確認している。この組み換え体蛋白は、dodecyl-maltosideには可溶化されず、pentadecafluorooctanoic acidに可溶化されることを見いだした。これら界面活性剤を組み合わせることにより、90%以上の部分精製が可能となった。また、native PAGEにより分離したTmlpはATPase活性を有していた。これより、これら界面活性剤用いてTmlpの活性を保持したまま膜から可溶化することが可能であることが明らかになった。更に、これら組み替え体にはHis Tag(ヒスチジン6個)付加してあり、Niカラムにより迅速に精製を行うことができるようにしてある。界面活性剤の組み合わせ可溶化及びNiカラム系を用いて、膜分画からの精製を試みる。精製後、リポソームへの再構成を行った。リポソーム再構成系を用いて、輸送基質の検索を行った。様々な脂溶性薬物(カチオン、アニオン、電気的中性)、水溶性薬物について検討したが、基質の同定にはいたらなかった。大腸菌での発現系では、活性を保持していない可能性も考えられる。そこで、高度好熱菌においての発現プラスミッドを用いて発現の構築を検討した。現在、その発現系を用いて、基質の同定を試みている。現在のところ、50種類の薬物を検討したが、どれも基質ではない結果となった。

For the purpose of substrate development, the construction of a large number of production system for Escherichia coli, TmlpA and TmlpB was attempted. 10% of membrane protein is present. Electrophoresis of Escherichia coli membrane proteins in PVDF membrane This protein is soluble in dodecyl-maltoside and pentadecloroacetic acid. More than 90% of the interface activity can be refined. Tmlp ATPase activity was isolated by native PAGE. The activity of Tmlp is maintained in the interface. More, this group of people instead of His Tag(6) pay more, Ni Interfacial active agent composition, solubilization and purification of Ni/Ni system, membrane separation and purification After purification, the composition of the solution is reformed. The composition of the system is composed of a matrix and a transport matrix. For example, fat-soluble substances (,, electrically neutral), water-soluble substances (,), matrix () E. coli production system, activity and maintenance of the possibility of The development of high temperature bacteria is discussed in detail. Now, the development of the system is in the middle of the process, the matrix is in the middle of the process. Now, 50 kinds of chemicals are discussed.

项目成果

Qing Yang et al.: "Membrane Partitioning and Translocation of Hydrophobic Phosphonuim Homologues : Thermodynamic Analysis by Immobilized Liposome Chromatography"Journal of Physical Chemistry B. 104. 7528-7534 (2000)

Qing Yang等：“疏水性膦酰亚胺同系物的膜分配和易位：固定化脂质体色谱法的热力学分析”物理化学杂志B.104.7528-7534(2000)

Masaki Komatsubara: "Cimetidine enhances the antiproliferation effect of 5-fluorouracil on colon carcinoma SW620"Anticancer Research. 19. 1153-1158 (1999)

小松原正树：“西咪替丁增强5-氟尿嘧啶对结肠癌SW620的抗增殖作用”抗癌研究。