高度好熱菌における動物細胞MDR類似輸送担体の機能解析

高度嗜热细菌中动物细胞MDR样转运载体的功能分析

• 批准号: 11771406
• 负责人: 宮内 正二
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11771406/
• 关键词: 高度好熱菌; ABC輸送担体; 多剤排出輸送担体; 大量発現; MDR; 膜蛋白

基質の検討を行う目的で、大腸菌のpET systemにより、TmlpAおよびTmlpBの大腸菌における大量発現系の構築を試みた。これら蛋白は膜蛋白の10%発現していた。大腸菌膜蛋白のSDS電気泳動をPVDF膜にブロッティングし、N末アミノ酸シークエンスを行い、目的とする蛋白であることを確認している。この組み換え体蛋白は、dodecyl-maltosideには可溶化されず、pentadecafluorooctanoic acidに可溶化されることを見いだした。これら界面活性剤を組み合わせることにより、90%以上の部分精製が可能となった。また、native PAGEにより分離したTmlpはATPase活性を有していた。これより、これら界面活性剤用いてTmlpの活性を保持したまま膜から可溶化することが可能であることが明らかになった。更に、これら組み替え体にはHis Tag(ヒスチジン6個)付加してあり、Niカラムにより迅速に精製を行うことができるようにしてある。界面活性剤の組み合わせ可溶化及びNiカラム系を用いて、膜分画からの精製を試みる。精製後、リポソームへの再構成を行った。リポソーム再構成系を用いて、輸送基質の検索を行った。様々な脂溶性薬物(カチオン、アニオン、電気的中性)、水溶性薬物について検討したが、基質の同定にはいたらなかった。大腸菌での発現系では、活性を保持していない可能性も考えられる。そこで、高度好熱菌においての発現プラスミッドを用いて発現の構築を検討した。現在、その発現系を用いて、基質の同定を試みている。現在のところ、50種類の薬物を検討したが、どれも基質ではない結果となった。

为了研究底物，我们尝试使用大肠杆菌的宠物系统在大肠杆菌中构建大型TMLPA和TMLPB的大规模表达系统。这些蛋白表示膜蛋白的10％。大肠杆菌膜蛋白的SDS电泳被印迹到PVDF膜上，并进行N末端氨基酸序列以确认它们是靶蛋白。发现该重组蛋白在十二烷基麦尔替剂中未溶解，而在五氟甲氟辛酸中溶解。通过组合这些表面活性剂，可以将90％或更多的部分净化。此外，通过天然页面隔离的TMLP具有ATPase活性。这表明可以在保留TMLP活性的同时，使用这些表面活性剂溶解膜。此外，将这些重组添加到他的标签（6个组氨酸）中，并使用Ni列允许快速纯化。使用Ni柱系统尝试了膜分数的表面活性剂溶解和纯化的组合。纯化后，将混合物重构为脂质体。使用脂质体重建系统来搜索运输基板。研究了各种脂溶性药物（阳离子，阴离子，电荷）和水溶性药物，但未鉴定出底物。大肠杆菌中的表达系统也可能不保留活性。因此，在高度嗜热细菌中使用表达质粒研究了表达构建。当前，表达系统被用于识别底物。目前，已经研究了50种药物，但没有一个是底物。

项目成果

Qing Yang et al.: "Membrane Partitioning and Translocation of Hydrophobic Phosphonuim Homologues : Thermodynamic Analysis by Immobilized Liposome Chromatography"Journal of Physical Chemistry B. 104. 7528-7534 (2000)

Qing Yang等：“疏水性膦酰亚胺同系物的膜分配和易位：固定化脂质体色谱法的热力学分析”物理化学杂志B.104.7528-7534(2000)

Masaki Komatsubara: "Cimetidine enhances the antiproliferation effect of 5-fluorouracil on colon carcinoma SW620"Anticancer Research. 19. 1153-1158 (1999)

小松原正树：“西咪替丁增强5-氟尿嘧啶对结肠癌SW620的抗增殖作用”抗癌研究。