古細菌の一種、高度好塩菌に存在する抗癌剤排出蛋白の分離精製及びその排出機構の解明

古细菌高嗜盐细菌中存在的抗癌药物排泄蛋白的分离和纯化以及排泄机制的阐明

• 批准号: 05857251
• 负责人: 宮内 正二
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05857251/
• 关键词: 多剤耐性; P-糖タンパク; 能動輸送

我々は、古細菌に属する高度好塩菌が動物細胞においてみられる抗癌剤に対する耐性機構を獲得し、その耐性機構が特殊な輸送担体を介した能動的排出によることを明らかにした。この排出は、Ca^<2+>拮抗薬により阻害されるなど、ヒトのP-糖蛋白に近い性質を有している。更に、能動的排出に利用されるエネルギーの検討を行ったところ、排出活性は細胞内ATPを非常に良く相関した。ATPの加水分解エネルギーを用いて排出を行っていることが示唆された。この抗癌剤排出蛋白をより詳細に検討をこなうため精製を行った。先ず、野生株及び耐性株を大量培養し、膜蛋白の検討を行った。SDS電気泳動パターンより、90KDa付近に耐性株特異的に多量発現している膜蛋白の存在が確認された。また、抗ヒトP-糖蛋白マウス・モノクローナル抗体(JSB-1)を用いたウェスタンブロットを行った。この結果、JSB-1はこの90KDaを特異的に認識した。ヒトのP-糖蛋白マウス・モノクローナル抗体(JSB-1)を用いたウェスタンブロットを行った。この結果、JSB-1はこの90KDaを特異的に認識した。ヒトのP-糖蛋白と比べて好塩菌の排出蛋白の分子量は約半分の値を示す。ヒトP-糖蛋白は、左右対照の構造をとっており、半分で排出機能を有していることは、大変興味深い。また。JSB-1で認識することより、好塩菌に存在する抗癌剤排出蛋白は、ヒトP-糖蛋白に近い構造を有していることが示唆される。この知見は、P-糖蛋白のルーツの考察に寄与すると考えられる。現在、オクチルグリコシドを用いて膜分画を可溶化し、この抗体との結合を指標として用いて精製を試みている。来年度は、本バクテリアに於て発現しているであろうP-糖蛋白類似輸送担体を同定分離精製を行い、物理化学的および分子生物学的観点からこの蛋白を研究する。この実験結果に基づいて抗癌剤排出のメカニズム(エネルギー変換機構)を詳細に検討してゆくつもりである。

我们已经表明，属于古细菌的高度卤素细菌已经获得了在动物细胞中看到的抗癌剂的耐药机制，并且耐药机制是由通过特殊运输载体的主动排泄引起的。这种排泄类似于人类P-糖蛋白的排泄，例如被Ca^<2+>拮抗剂抑制。此外，当我们研究用于主动疏散的能量时，外排活动与细胞内ATP非常相关。建议使用ATP的水解能进行发射。将这种抗癌药外排蛋白纯化以更详细地进一步研究。首先，培养了大量的野生和抗性菌株，并检查了膜蛋白。 SDS电泳模式证实了在90 kDa约90 kDa的抗性菌株中特别表达的膜蛋白的存在。此外，使用抗人P-糖蛋白小鼠单克隆抗体（JSB-1）进行蛋白质印迹。结果，JSB-1专门识别了这一90KDA。使用人P-糖蛋白小鼠单克隆抗体（JSB-1）进行蛋白质印迹。结果，JSB-1专门识别了这一90KDA。与人P-糖蛋白相比，卤素细菌外排蛋白的分子量约为分子量的一半。有趣的是，人P-糖蛋白具有左右控制结构，并且将排泄的功能分为一半。还。 JSB-1的识别表明，卤素中存在的抗癌剂外排蛋白具有与人P-糖蛋白相似的结构。人们认为这一发现有助于检查P-糖蛋白的根。当前，单基糖苷用于溶解膜级分，并尝试使用与该抗体的结合作为指标进行纯化。明年，我们将识别和分离并净化可能在该细菌中表达的P-糖蛋白样载体，并从物理化学和分子生物学的角度研究该蛋白质。根据该实验的结果，我们打算详细研究抗癌药物排泄的机制（能量转化机制）。

项目成果

M.Komatsubara et al.: "Characterization of cloxorubicin-efflux pump in archaebacteria:This pump recognizes many structurally unrelated compounds and is energiqed by ATP." Biochim. Biophys. Acta. (in press).

M.Komatsubara 等人：“古细菌中氯霉素外排泵的特征：该泵可识别许多结构上不相关的化合物，并由 ATP 提供能量。”