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ノックアストマウスによるDRPLA遺伝子の機能と発現分布に関する研究

利用敲除小鼠研究DRPLA基因的功能和表达分布

基本信息

批准号：
12770311
负责人：
小宅睦郎
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Niigata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的はポリグルタミン病の一つである歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症(DRPLA)の原因遺伝子の生理的機能を固体レベルで明らかにし、かつ時間的空間的な遺伝子発現分布パターンについて明らかにすることにより患者中枢神経系において見られる選択的神経変性との関わりを検討することにある。そのためDRPLA遺伝子ノックアウトマウスの作成を行った。この際単に標的遺伝子の欠失を行うのみでなく、DRPLA遺伝子の内在性プロモータの制御下にレポータ遺伝子を発現するような工夫を行った。容易に組織レベルで解析可能なようにレポータ遺伝子としてβgalactosidase遺伝子を用いた。ターゲッティングベクターの構築マウス129SvゲノムライブラリーよりマウスDRPLA c DNAをプローブとして、マウスDRPLAゲノムDNAをクローン化した。その結果エキソン1からエキソン10までを含む全長約17kb.のゲノム断片をクローン化した。このクローンについて詳細な制限酵素地図を作成した後、5側相同領域として2.4kb.を3側相同領域として7.1kb.を有するように、またDRPLA遺伝子を欠失させるためにエキソン2の翻訳開始点より上流よりレポタ遺伝子としてβgalactosidase遺伝子とネオマイシン耐性遺伝子を挿入した。ES細胞でのジーンターゲッティングとキメラマウスの作成、ノックアウトマウスの系統樹立エレクトロフォレーション法により2.3×107個のES細胞(CCE)を用いて遺伝子を導入した。ネオマイシンによる薬剤選択で得られた120クローンについてサザンブロット法により標的遺伝子組み換え体を検索したところ12クローンで標的遺伝子組み替えが生じていた。このうち一種類のES細胞からC57BL6の胚盤胞導入によりキメラマウスを作成したところgermline transmissionが得られた。Germline transmissionにより得られたヘテロマウスを交配し得られたマウスについてgenotypeを解析したところDRPLA遺伝子を欠失したホモ接合体が得られた。

The purpose of this study is to investigate the physiological function of the causal gene of DRPLA, and the spatial distribution of the gene. The DRPLA is the best way to create it. The time required for the development of DRPLA's internal transmission system is limited by the absence of DRPLA's internal transmission system. Easy to organize, easy to parse, easy to use beta galactosidase. The structure of DRPLA is 129Sv, and the DRPLA is 129Sv. The total length of the fragment is about 17kb. After the completion of the restriction enzyme site, 5 sides of the same field were 2.4kb. 3 sides of the same field were 7.1kb. The DRPLA gene was missing. 2 was turned over to the starting point. 3 was turned over to the upstream gene. 4 was turned over to the βgalactosidase gene. 3 was turned over to the resistant gene. The 2.3×107 ES cells (CCE) were used to introduce genes into the production of ES cells and the systematic establishment of ES cells using the Erector Fluorotechnology method. In addition to the above, it is also possible to select a subset of the target group from the list of 120 target groups. A new type of ES cell is introduced into the blastoderm of C57BL 6. Germline transmission is not available. It is not available. It is not available.