放射線に応答し細胞内局在を変化するDNA二重鎖切断修復蛋白質の同定と機能解析

1)電離放射線に応答し細胞内局在を変化する蛋白質の探索できるだけ多くの候補蛋白質を得るために、昨年度確立した、電離放射線に応答し細胞内局在を変化する蛋白質を同定するための方法を用いたスクリーニングを引き続き行った。蛋白質の局在変化を調べるために、GFP融合蛋白質として発現する様にGFP遺伝子の下流に各cDNAを組み込んだ遺伝子発現ベクターライブラリーからの各遺伝子発現ベクターをプラスミドとして調整し、これをマイクロタイタープレートに培養しておいたヒト培養細胞ヘリポソーム法を用いて遺伝子導入した。遺伝子導入した培養細胞はGFP融合蛋白質を充分発現させるために、遺伝子導入後2晩培養した。培養後、このプレートを倒立蛍光顕微鏡で1穴毎に観察を行い、細胞内の局在を同定した。ついで、電離放射線照射装置により放射線を照射後、一定期間培養した後で、照射前の同じ方法で細胞内の局在を同定・記録した。2)候補蛋白質からのスクリーニング照射前後に融合蛋白質の局在が変化していたベクターについては、保存していたプラスミドを用いて自動シークエンサーによりDNAの塩基配列を順次行っている。また、候補蛋白質のDNAの塩基配列を公表されている塩基配列情報と照合し、既知の蛋白質と新規蛋白質に分類している。既知の蛋白質としては、これまでに、Rad familyに属する蛋白質等が同定されている。今後、記録したデータの解析を引き続き行うとともに、同定された蛋白質についてその局在変化の特徴について解析を行う予定である。3)DNA二重鎖切断修復に関与する蛋白質の同定電離放射線によるDNA二重鎖切断修復機構で機能する新たな蛋白質を同定するためには、まず、既知の蛋白質についての特徴を理解する必要がある。そこで、DNA二重鎖切断の修復機構で働く既知の蛋白質(Ku70,Ku80,Xrcc4等)の細胞内局在とその局在変化について解析を行った。その結果、Ku蛋白質の核局在化には核移行シグナルとともにヘテロダイマーの形成が重要であることが明らかになった。

1)電離放射線に応答し細胞内局在を変化する蛋白質の探索できるだけ多くの候補蛋白質を得るために、昨年度確立した、電離放射線に応答し細胞内局在を変化する蛋白質を同定するための方法を用いたスクリーニングを引き続き行った。蛋白質の局在変化を調べるために、GFP融合蛋白質として発現する様にGFP遺伝子の下流に各cDNAを組み込んだ遺伝子発現ベクターライブラリーからの各遺伝子発現ベクターをプラスミドとして調整し、これをマイクロタイタープレートに培養しておいたヒト培養細胞ヘリポソーム法を用いて遺伝子導入した。遺伝子導入した培養細胞はGFP融合蛋白質を充分発現させるために、遺伝子導入後2晩培養した。培養後、このプレートを倒立蛍光顕微鏡で1穴毎に観察を行い、細胞内の局在を同定した。ついで、電離放射線照射装置により放射線を照射後、一定期間培養した後で、照射前の同じ方法で細胞内の局在を同定・記録した。2)候補蛋白質からのスクリーニング照射前後に融合蛋白質の局在が変化していたベクターについては、保存していたプラスミドを用いて自動シークエンサーによりDNAの塩基配列を順次行っている。また、候補蛋白質のDNAの塩基配列を公表されている塩基配列情報と照合し、既知の蛋白質と新規蛋白質に分類している。既知の蛋白質としては、これまでに、Rad familyに属する蛋白質等が同定されている。今後、記録したデータの解析を引き続き行うとともに、同定された蛋白質についてその局在変化の特徴について解析を行う予定である。3)DNA二重鎖切断修復に関与する蛋白質の同定電離放射線によるDNA二重鎖切断修復機構で機能する新たな蛋白質を同定するためには、まず、既知の蛋白質についての特徴を理解する必要がある。そこで、DNA二重鎖切断の修復機構で働く既知の蛋白質(Ku70,Ku80,Xrcc4等)の細胞内局在とその局在変化について解析を行った。その結果、Ku蛋白質の核局在化には核移行シグナルとともにヘテロダイマーの形成が重要であることが明らかになった。