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放射線に応答し細胞内局在を変化するDNA二重鎖切断修復蛋白質の同定と機能解析

响应辐射而改变细胞内定位的 DNA 双链断裂修复蛋白的鉴定和功能分析

基本信息

批准号：
12780412
负责人：
小池学
金额：
$ 1.22万
依托单位：
National Institute of Radiological Sciences
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12780412/
关键词：
Ku70 Ku80 localization GFT DNA二重鎖切断修復 GFP

项目摘要

1)電離放射線に応答し細胞内局在を変化する蛋白質の探索できるだけ多くの候補蛋白質を得るために、昨年度確立した、電離放射線に応答し細胞内局在を変化する蛋白質を同定するための方法を用いたスクリーニングを引き続き行った。蛋白質の局在変化を調べるために、GFP融合蛋白質として発現する様にGFP遺伝子の下流に各cDNAを組み込んだ遺伝子発現ベクターライブラリーからの各遺伝子発現ベクターをプラスミドとして調整し、これをマイクロタイタープレートに培養しておいたヒト培養細胞ヘリポソーム法を用いて遺伝子導入した。遺伝子導入した培養細胞はGFP融合蛋白質を充分発現させるために、遺伝子導入後2晩培養した。培養後、このプレートを倒立蛍光顕微鏡で1穴毎に観察を行い、細胞内の局在を同定した。ついで、電離放射線照射装置により放射線を照射後、一定期間培養した後で、照射前の同じ方法で細胞内の局在を同定・記録した。2)候補蛋白質からのスクリーニング照射前後に融合蛋白質の局在が変化していたベクターについては、保存していたプラスミドを用いて自動シークエンサーによりDNAの塩基配列を順次行っている。また、候補蛋白質のDNAの塩基配列を公表されている塩基配列情報と照合し、既知の蛋白質と新規蛋白質に分類している。既知の蛋白質としては、これまでに、Rad familyに属する蛋白質等が同定されている。今後、記録したデータの解析を引き続き行うとともに、同定された蛋白質についてその局在変化の特徴について解析を行う予定である。3)DNA二重鎖切断修復に関与する蛋白質の同定電離放射線によるDNA二重鎖切断修復機構で機能する新たな蛋白質を同定するためには、まず、既知の蛋白質についての特徴を理解する必要がある。そこで、DNA二重鎖切断の修復機構で働く既知の蛋白質(Ku70,Ku80,Xrcc4等)の細胞内局在とその局在変化について解析を行った。その結果、Ku蛋白質の核局在化には核移行シグナルとともにヘテロダイマーの形成が重要であることが明らかになった。

1)Ionizing radiation is used to detect proteins in the intracellular structure and to identify candidate proteins. The GFP fusion protein is expressed in the downstream of GFP gene, and the cDNA is expressed in the downstream of GFP gene. The cDNA is expressed in the downstream of GFP fusion protein. The cDNA is expressed in the downstream of GFP fusion protein. The cDNA is introduced into GFP fusion cells by the method of gene expression. GFP fusion protein was fully expressed in cultured cells after gene introduction, and cultured 2 days after gene introduction. After culture, the cells were observed by inverted microscope, and the intracellular conditions were determined simultaneously. After irradiation with ionizing radiation, culture for a certain period of time, and before irradiation, the same method is used to record the intracellular conditions. 2)Candidate proteins are selected before and after irradiation, and fusion proteins are transformed, preserved, and used to automatically select fusion proteins before and after irradiation. The DNA base alignment of candidate proteins is disclosed in the table. The base alignment information is aligned with the known proteins and the new protein classification. It is known that proteins belong to the same family. In the future, record the analysis of the protein in the analysis of the characteristics in the analysis of the predetermined line. 3) It is necessary to understand the characteristics of DNA double-lock repair related to protein isostatic ionization radiation and DNA double-lock repair mechanism. The repair mechanism of DNA double-lock cleavage is analyzed in the cellular structure of known proteins (Ku70, Ku80, Xrcc4, etc.). As a result, Ku protein is in the process of nuclear migration.