GFPトランスジェニックマウスを用いた生物時計の可視化と再構成

使用 GFP 转基因小鼠观察和重建生物钟

• 批准号: 13878136
• 负责人: 村田 昌之
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Okazaki National Research Institutes
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13878136/
• 关键词: 概日リズム; GFP可視化; トランスジェニックマウス; 初代培養細胞; セミインタクト細胞; 視交差上核; 発現可視化

哺乳類の概日リズム(サーカディアンリズム)発振の分子メカニズムを明らかにするため、マウス時計遺伝子mPer遺伝子上流配列(プロモーター領域を含む)にレポーター遺伝子としてd1-GFP遺伝子(改変型GFP)を繋いだ遺伝子(mPer-d1-GFP)を作成し、mPer-d1-GFP遺伝子を持ったトランスジェニックマウスを作成した。d1-GFPとは、哺乳類細胞内で半減期約1時間で分解を受ける改変型のGFPである。そのため、mPer遺伝子を発現する臓器の細胞内で、約一時間だけ蛍光を発することができる。つまり、トランスジェニックマウスのSCNニューロン及びmPer遺伝子を発現している臓器(の細胞)は、概日リズムと同期して蛍光を発することになる。作成したトランスジェニックマウスの初期培養SCNニューロンは、自家蛍光が強いがそれをバックグラウンドとして周期的な(概日リズムに対応した)蛍光を発することを確認した。今回の研究期間中には、マウスの作成、その系統維持。初代培養細胞での概日リズム確認までを行った。この間に、いろいろな時計関連遺伝子が同定されまたその遺伝子産物間の相互作用などが次々と明らかのなってきている。今後、これら同定された遺伝子産物のGFP融合タンパク質(または、GFP変異体融合タンパク質、CFP,YFPなど)を無細胞系タンパク質発現系を用いて発現・精製し、セミインタクトSCN細胞を用いた単一細胞レベルでの「時計」の再構成系を構築する予定である。現在、共同研究により、gene chipを用いた時計遺伝子の網羅的解析と変動遺伝子の抽出、抽出遺伝子産物の無細胞タンパク質発現系を用いた発現システムの構築を進めている。

Mammalian DNA sequence analysis: DNA sequence analysis: DNA sequence analysis. The half-life of d1-GFP in mammalian cells is about 1 time. The expression of mPer gene in the cells of the organ takes about one minute to complete. The SCN and mPer genes are generated in the cells, and the cells are generated in the cells. Make sure that the initial culture of SCN is stable and stable. During this study period, the system was maintained. The initial culture cells were confirmed to be in good condition. The interaction between these two genetic products has been studied. In the future, the GFP fusion protein (CFP,YFP) of the same gene product will be developed, refined, and reconstructed in a cell line-free plasmid generation system using SCN cells. Now, we are working together to analyze the use of gene chips and the construction of cell-free gene expression systems for gene chip extraction and extraction.

项目成果

Tanaka Arow: "Effect of mutations of ABCA1 in the first extracellular domain on subcellular trafficking and ATP binding/hydrolysis"Journal of Biological Chemistry. 278. 8815-8819 (2003)

Tanaka Arow：“第一胞外域中 ABCA1 突变对亚细胞运输和 ATP 结合/水解的影响”生物化学杂志。

田中亜路: "哺乳動物細胞オルガネラの細胞周期依存的ダイナミクス"生物物理. 241. 116-121 (2002)

Aji Tanaka：“哺乳动物细胞器的细胞周期依赖性动力学”生物物理学 241. 116-121 (2002)。

村田昌之: "よくわかる細胞内輸送"エンドサイトーシスの分子メカニズム. 45-53 (2002)

Masayuki Murata：“易于理解的细胞内运输”内吞作用的分子机制 45-53 (2002)。

加納ふみ: "細胞内小胞輸送ネットワークの可視化解析"実験医学. 20. 961-967 (2002)

Fumi Kano：“细胞内囊泡运输网络的可视化分析”实验医学 20. 961-967 (2002)。

加納ふみ: "細胞内イベントを操作するセミインタクト細胞系-新しいナノテクノロジーの基盤デバイスとして"生体の科学. 52. 340-346 (2001)

Fumi Kano：“用于操纵细胞内事件的半完整细胞系统 - 作为新纳米技术的基本装置”生物科学 52. 340-346 (2001)。