VIP17を核としたゴルジ体輸送小胞への輸送物質組込の新エスコート蛋白質の同定

鉴定出一种以 VIP17 为核心将转运物质纳入高尔基体转运囊泡的新型护航蛋白

• 批准号: 10172235
• 负责人: 村田 昌之
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: Okazaki National Research Institutes
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10172235/
• 关键词: ゴルジ体; 細胞内小胞輸送; セミインタクト細胞; GFP; 細胞極性

極性細胞内の小胞輸送におけるVIP17等の蛋白質の機能を研究するための新規な細胞内小胞輸送アッセイ系を確立した。まず、ゴルジ体局在化シグナルを持つガラクトシルトランスフェラーゼと緑色蛍光蛋白質(GFP)との融合蛋白質(GFP-GT)を、恒常的に発現しているCHO細胞・MDCK細胞を得た。蛍光性膜蛋白質(GFP-GT)をプローブとすることにより、共焦点レーザー蛍光顕微鏡・超高感度ビデオ付き蛍光顕微鏡。エバネセント蛍光顕微鏡下で、「単一」の細胞内のGFP-GTの輸送過程を経時的に追跡できた。また、フォトカウントシステムを用い、小胞体→ゴルジ体間の輸送のキネティックスを「定量的」に解析することができた。この結果、輸送小胞には少なくとも3種類の小胞があり、それぞれが微小管依存的にダイナミックに動く様子が世界で初めて観察できた。また、ストレプトリシンO(SLO)を用いて形質膜を部分的に透過性にしたセミインタクト細胞内で、この輸送過程を、ATP再生系とL5178Y細胞の細胞質を用い再構成することに成功した。セミインタクト細胞内での輸送過程を上記顕微鏡システムを用いて追跡・解析した結果、小胞体からゴルジ体への輸送過程をATP-依存的な過程、ATP-細胞質-依存的な過程の、少なくとも2つの素過程にdissectionすることができた。また、輸送に関わる中間体としてダンベル状の大きさ約0.3-0.5μmの輸送小胞が頻繁に観察され、ATPをdepletionした場合、その数は激減した。この中間体が、今まで報告されている「intermediate compartment」又は「pre-Golgi structure」である可能性が高い。この再構成システムを用いることにより、それぞれの過程に関与する細胞質因子や、輸送中間体(小胞)のダイナミクスを制御する因子の検索が可能となった。

Study on the Function of Proteins such as VIP17 in Cellular Transport in Polar Cells and Establishment of New Cellular Transport System The expression of GFP and fusion protein (GFP-GT) in CHO cells and MDCK cells was observed regularly. Optical Membrane Protein (GFP-GT): Optical Microscope, Confocal Point, Ultra-Sensitive Optical Microscope The process of GFP-GT transport in a single cell was traced under microscope. "Quantitative" analysis of transport between cells and cells As a result, the transport cell is less than three kinds of cells, and the microtube-dependent cell is the first to be detected. In addition, the ATP regeneration system and the cytoplasmic reconstitution of L5178Y cells were successfully used for the permeability of the plasma membrane. The transport process in the cell is described in detail. The results of microscopical analysis show that the transport process in the cell is ATP-dependent, ATP-cytoplasmic-dependent, and the transport process in the cell is dissected. The transport cell size of 0.3-0.5μm is frequently detected, and ATP is depleted. This intermediate is now reported as "intermediate compound" and "pre-Golgi structure". The molecular structure of these proteins is related to the process of cytoplasmic factors, transport intermediates (small cells) and molecular control factors.

项目成果

大橋正人: "An arrested late endosome-lysosome intermediate aggregate observed in a Chinese hamster ovary cell mutant isolated by novel three-step screening" Journal of Cell Science. (in press). (1999)

Masato Ohashi：“通过新颖的三步筛选在中国仓鼠卵巢细胞突变体中观察到的晚期内体-溶酶体中间聚集体”（正在出版）。

加納ふみ: "ゴルジ体のバイオジェネシス-極性細胞でのin situ biochemistry & biophysics-" 生物物理. 39巻1号. 29-33 (1999)

Fumi Kano：“高尔基体的生物发生 - 极化细胞中的原位生物化学和生物物理学”，《生物物理学》，第 39 卷，第 1. 29-33 期（1999 年）。

村田昌之: "Caveolin is a cholesterol-binding protein" Proceedings of the Inemational Symposium on Lipoprotein Metabolism and Atherogenesis. (in press). (1999)

Masayuki Murata：“Caveolin 是一种胆固醇结合蛋白”脂蛋白代谢和动脉粥样硬化注射研讨会论文集（1999 年出版）。