セミインタクト細胞を駆使した細胞ストレス応答ネットワークの定量的可視化解析

使用半完整细胞对细胞应激反应网络进行定量可视化分析

• 批准号: 17017012
• 负责人: 村田 昌之
• 金额: $ 4.16万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-17017012/
• 关键词: 細胞ストレス; リン酸化; 翻訳制御; 可視化; セミインタクト細胞; 核移行; mRNA; 生体シュミレーション

本研究では、細胞膜を透過性にした「セミインタクト細胞」に、ストレスにさらされた細胞から調製した細胞質を導入し、ストレス負荷時に翻訳が活性化される転写因子ATF4の発現の可視化・再構成を行い、ストレス依存的な翻訳制御の分子機構を明らかにすることを目的とした。先ず、1)ATF4mRNAを恒常的に発現する細胞株の樹立した。2)生細胞におけるATF4-GFPのストレス応答反応の可視化した。CHO-ATF4細胞に小胞体ストレス(タプシガルジン、DTT処理など)や酸化ストレスを負荷することにより、ATF4-GFPがストレス依存的に翻訳され、核内に移行することを確認した。この細胞株のATF4mRNA量はストレス負荷時、ストレスのない場合においても殆ど変化していないことをRT-PcRやノーザンプロットにより確認した。3)セミインタクト細胞を用いたストレス依存的ATF4-GFPの翻訳制御の可視化・再構成系の構築した。CHO-ATF4細胞をセミインタクト細胞処理し、小胞体ストレス(タプシガルジンやDTT等)を負荷したCHO細胞(WT)より調製した細胞質を添加し、ATF4-GFPの翻訳制御の再構成を試みた。その結果、ストレス負荷細胞質依存的にATF4-GFPが翻訳され、かつそれが核内に効率よく輸送されることを確認できた。ATF4-GFPは分子量約70kDaでの転写因子であり、例え発現したとしてもセミインタクト細胞の穴より細胞外へ拡散してゆくことが危惧されていたが、非常に効率よく核に移行することより、本再構成アッセイ系が翻訳制御の可視化再構成系として十分使用できること、また、セミインタクト細胞内では転写因子のような核移行する分子は何らかの方法で(恐らく微小管依存的に)核にターゲットできることが明らかとなった。これらの結果より、各種ストレス依存的な翻訳制御ネットワークの可視化解析を行う準備ができた。

The aim of this study is to visualize and reconstruct the expression of ATF4 in cell membrane permeability, cell membrane modulation, and cell cytoplasm under stress. First, 1) ATF4 mRNA is constantly expressed in cell lines. 2)The ATF4-GFP gene was used to visualize the growth of human cells. CHO-ATF4 cell microsomata (including DTT treatment), DNA transfer, ATF4-GFP dependent DNA transfer, and nuclear translocation were confirmed. The amount of ATF4 mRNA in these cell lines was determined by RT-PCR when the cells were loaded. 3) Construction of ATF4-GFP control and visualization/reconstruction system for cell use. CHO-ATF4 cells were loaded with cell processing, cell culture (DTT, etc.), modulation, cytoplasmic addition, ATF4-GFP transformation and reconstitution. As a result, ATF4-GFP, a cytoplasm-dependent protein, has been identified as an intracellular protein transporter. ATF4-GFP has a molecular weight of about 70kDa, and its molecular weight is about 70 kDa. It can be found in the extracellular matrix of cells. It can be used in many ways. The method of molecular nuclear migration in the cell is described in detail below. The result of this analysis is to prepare for the visualization of all kinds of data.

项目成果

The maintenance of the ER network is regulated by p47, a cofactor of p97, through phosphorylation by cdc2 kinase

ER 网络的维持由 p47（p97 的辅助因子）通过 cdc2 激酶磷酸化来调节

• 发表时间: 2005
• 期刊: Genes to Cells 10
• 作者: Kano;F.
• 通讯作者: F.

セミインタクト細胞アッセイ

半完整细胞测定

• 发表时间: 2005
• 期刊: リボソーム応用の新展開 人工細胞の開発に向けて(秋吉一成, 辻井薫監修)(NTS出版)
• 作者: Kano;F.;山内忍;村田昌之
• 通讯作者: 村田昌之

Reconstitution of Golgi disassembly by mitotic Xenopus egg extracts in semi-intact MDCK cells.

通过有丝分裂爪蟾卵提取物在半完整 MDCK 细胞中重建高尔基体分解。

• 发表时间: 2005
• 期刊: Methods in Molecular Biology
• 作者: Kano;F.
• 通讯作者: F.

セミインタクト細胞を用いた細胞内イベントの可視化解析

使用半完整细胞对细胞内事件进行可视化分析

• 发表时间: 2005
• 期刊: 生物物理 45
• 作者: Kano;F.;山内忍
• 通讯作者: 山内忍