セミインタクト細胞を駆使した細胞ストレス応答ネットワークの定量的可視化解析

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本研究では、細胞膜を透過性にした「セミインタクト細胞」に、ストレスにさらされた細胞から調製した細胞質を導入し、ストレス負荷時に翻訳が活性化される転写因子ATF4の発現の可視化・再構成を行い、ストレス依存的な翻訳制御の分子機構を明らかにすることを目的とした。先ず、1)ATF4mRNAを恒常的に発現する細胞株の樹立した。2)生細胞におけるATF4-GFPのストレス応答反応の可視化した。CHO-ATF4細胞に小胞体ストレス(タプシガルジン、DTT処理など)や酸化ストレスを負荷することにより、ATF4-GFPがストレス依存的に翻訳され、核内に移行することを確認した。この細胞株のATF4mRNA量はストレス負荷時、ストレスのない場合においても殆ど変化していないことをRT-PcRやノーザンプロットにより確認した。3)セミインタクト細胞を用いたストレス依存的ATF4-GFPの翻訳制御の可視化・再構成系の構築した。CHO-ATF4細胞をセミインタクト細胞処理し、小胞体ストレス(タプシガルジンやDTT等)を負荷したCHO細胞(WT)より調製した細胞質を添加し、ATF4-GFPの翻訳制御の再構成を試みた。その結果、ストレス負荷細胞質依存的にATF4-GFPが翻訳され、かつそれが核内に効率よく輸送されることを確認できた。ATF4-GFPは分子量約70kDaでの転写因子であり、例え発現したとしてもセミインタクト細胞の穴より細胞外へ拡散してゆくことが危惧されていたが、非常に効率よく核に移行することより、本再構成アッセイ系が翻訳制御の可視化再構成系として十分使用できること、また、セミインタクト細胞内では転写因子のような核移行する分子は何らかの方法で(恐らく微小管依存的に)核にターゲットできることが明らかとなった。これらの結果より、各種ストレス依存的な翻訳制御ネットワークの可視化解析を行う準備ができた。